【摘要】目的：研究核因子-κB诱骗寡核苷酸（nuclear factor-κB decoy oligodeoxynucleotide，NF-κB decoy ODN）对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的保护作用。方法：设计、合成NF-κB decoy ODN和错配NF-κB decoy ODN的核苷酸序列。采用升高眼内压的方法建立大鼠视网膜缺血再灌注模型。缺血前10min，玻璃体内注射NF-κB decoy ODN或错配NF-κB decoy ODN。再灌注24h后，观察视网膜的组织学变化，测定视网膜的髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）活力。检测缺血前10min和再灌注24h的闪光视网膜电图（flash electroretinography，F-ERG），计算其b波振幅恢复率。结果：缺血的大鼠视网膜再灌注24h后，视网膜明显充血、水肿，有许多白细胞浸润，神经节细胞和内核层细胞减少，且视网膜MPO 活力增加（P ＜0.05）、b波振幅恢复率下降（P ＜0.05）。玻璃体注射NF-κB decoy ODN的大鼠，视网膜的损伤性组织学改变减轻，MPO 活力降低，b波振幅恢复率增加。而玻璃体注射错配NF-κB decoy ODN则无此作用。结论：玻璃体注射NF-κB decoy ODN能有效抑制大鼠视网膜缺血再灌注损伤，保护视网膜功能。

   【关键词】  NF-κB　诱骗寡核苷酸　视网膜　再灌注损伤　大鼠

　　
    Alleviation of NF- κB decoy oligodeoxyn- ucleotides on retinal ischemia-reperfusion injury in rats

    Jun-Feng Mao, Yuan-Kui Yan, Yu-De Ai, Shuang-Zhen Liu

    Department of Ophthalmology, Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China

    Correspondence to: Jun-Feng Mao. Department of Ophthalmology, Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China. [email protected]

    Received：2006-10-03 Accepted:2006-12-11

    Abstract

    · AIM: To investigate the protective effects of NF-κB decoy ODN on retinal ischemia-reperfusion injury in rats.

    · METHODS: NF-κB decoy ODN and scrambled NF-κB decoy ODN were synthesized. Retinal ischemia was induced by increasing the intraocular pressure in rats. NF-κB decoy ODN or scrambled NF-κB decoy ODN was injected into the vitreal chamber at 10 minutes before retinal ischemia. The retinal histologic changes were observed and the activity of retinal myeloperoxidase(MPO) was analyzed. The recovery rate of F-ERG b wave amplitude was measured at 10 minutes before retinal ischemia and 24 hours after reperfusion.

    · RESULTS: The retinal hyperaemia and edema were observed and a lot of leukocytes infiltrated in retina with the ganglion cells and inner nuclear cells reducing at 24 hours after reperfusion. Moreover, the increasing of retinal MPO activity and decreasing of the recovery rate of b wave amplitude were found. Intravitreally injected NF-κB decoy ODN could ameliorate the histologic changes of retinal reperfusion injury, reduce retinal MPO activity and enhance the recovery rate of b wave amplitude. However, the protective effects on retinal reperfusion injury were not observed with scrambled AP-1 decoy ODN.

    · CONCLUSION: Intravitreally injected NF-κB decoy ODN could effectively ameliorate retinal ischemia-reperfusion injury and rescue retinal function in rats.

    · KEYWORDS: NF-κB; decoy oligodeoxynucleotide; retina; reperfusion injury; rat

    Mao JF, Yan YK, Ai YD, Liu SZ. Alleviation of NF-κB decoy oligodeoxynucleotides on retinal ischemia-reperfusion injury in rats. Int J Ophthalmol (Guoji Yanke Zazhi),2007;7(1):73-75

　　0引言

    诱骗寡核苷酸（decoy oligodeoxynucleotide，decoy ODN）是近年来倍受关注的一个特异性针对转录因子的新型抗基因策略。它是与细胞转录因子激活的目的基因启动子区域的核苷酸序列相同的一种双链ODN，能竞争性地俘获活化的转录因子，快速、高效、靶向性地抑制细胞内转录因子的激活，进而抑制目的基因表达[1]。目前，decoy ODN技术在眼科领域的应用较少。研究表明，视网膜缺血再灌注后引起的过度炎症反应是造成再灌注损伤的主要原因之一[2]。由于核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是调控许多炎症因子表达的分子开关[3]，因此我们设计、合成NF-κB decoy ODN，研究其对高眼压诱导的大鼠视网膜缺血再灌注损伤的保护作用。

    1材料和方法

    1.1材料 从转录因子数据库Transfac中选取了NF-κB的结合序列，计算机辅助设计NF-κB decoy ODN及作为对照的错配NF-κB decoy ODN的核苷酸序列,由上海生工生物工程公司用Applied Biosystem 391 DNA自动合成仪合成，3'－末端进行硫代修饰。等摩尔的互补单链ODN混和，98℃水浴5min，缓慢冷却至室温，形成哑铃形结构，-20℃保存备用。健康Wistar大白鼠60只，雌雄兼用，7周龄，体质量220～250g。随机分为5组：正常对照组（A）、缺血再灌注组（B）、缺血再灌注＋脂质体Lipofect组（C）、缺血再灌注＋NF-κB decoy ODN＋Lipofect组（D）、缺血再灌注＋错配NF-κB decoy ODN＋Lipofect组（E），每组12只。

    1.2方法 采用升高眼内压的方法造成视网膜缺血。3g/L戊巴比妥钠（50mg/kg）ip，同时用托吡卡胺滴眼液扩瞳。麻醉成功后，将连接乳酸林格液瓶输液管的7号头皮针经右眼角膜周边刺入眼前房，升高输液瓶至与大鼠垂直距离150cm处（此高度可在大鼠眼内产生14.63kPa（1kPa＝7.5mmHg）的压力，这一压力接近Wistar大鼠的体循环收缩压，能完全阻断视网膜血流），此时肉眼见球结膜苍白、眼底镜下见视网膜缺血。60min后，拔出针头，见球结膜充血、视网膜血液再灌注，维持视网膜恢复血供24h。视网膜缺血前10min，C，D，E组大鼠右眼玻璃体内分别注射脂质体Lipofect 50μg，NF-κB decoy ODN10μg＋Lipofect 50μg、错配NF-κB decoy ODN10μg＋Lipofect 50μg，注射体积均为50μL。采用重庆TEC-100C+视觉电生理检查仪检测视网膜缺血前和再灌注24h时的闪光视网膜电图（flash electroretinography，F-ERG）。检查前腹腔注射3g/L戊巴比妥钠（50mg/kg）麻醉大鼠，托吡卡胺滴眼液扩瞳，暗适应30min。记录电极置于角膜表面，参考电极、地电极分别刺入前额正中和耳根部皮下。记录右眼ERG b波振幅值（a波波谷至b波波峰之间的距离，单位：V），每只大鼠测3次，取平均值。ERG检测完毕，立即用颈椎脱臼法处死大鼠，摘除眼球，去除眼前节和玻璃体。每组中各取2个眼杯，固定于40g/L中性甲醛缓冲液中，作石蜡切片，用于常规HE染色；取剩余眼杯的视网膜，液氮固定，作髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）活力测定。另取液氮固定的视网膜组织，冷生理盐水漂洗3次，滤纸吸干后称质量，加PBS制成匀浆，超声粉碎。4℃ 43 000r/min离心15min，取上清液，以1∶30与反应液（磷酸邻联茴香胺16.7mg、50mmol/L PBS 10mL、蒸馏水90mL，加入H2O2至其终浓度为5mg/L混合。分光光度计测定460nm波长时2min内光密度的变化值。MPO活力以25℃时1min分解H2O2 1mol表示。

    统计学处理：所有数据用 　　表示，用SPSS11.0统计软件包进行分析。各组间大鼠F-ERG b波振幅恢复率、视网膜MPO活力的比较采用One-way ANOVA检验，两两比较用LSD法，方差不齐时改用非参数秩和检验。 P <0.05表示差异有统计学意义。

    2结果

    2.1F-ERG b波振幅的变化 根据潘爱华等[4]的报道，计算b波振幅恢复率（缺血前b波振幅值/再灌注24h的b波振幅值×100％）。B组大鼠F-ERG b波振幅恢复率低于A组，两者比较差异有统计学意义 (P <0.05，表1)。玻璃体内注射NF-κB decoy ODN的大鼠b波振幅恢复率升高，但仍低于A组( P <0.05，表1)。C组、E组b波振幅恢复率均低于A组和D组(P <0.05，表1)，而与B组的差异则均无统计学意义 (P ＞ 0.05，表1)。

    2.2视网膜组织学变化 正常大鼠视网膜组织结构与人相似，神经节细胞单层排列，核较大，圆形或椭圆形，染色较浅；内核层较薄，有3～6层细胞；外核层较厚，有7～10层细胞，核较小，染色深，排列紧密；内丛状层明显厚于外丛状层，呈网状（图1A）。再灌注24h后，内层视网膜明显充血、水肿，有较多附壁、浸润的白细胞；神经节细胞稀疏；内核层排列紊乱，且数量减少（图1B）。玻璃体内注射NF-κB decoy ODN组的视网膜水肿减轻、白细胞减少；内核层细胞数量增加（图1C）。玻璃体内注射错配NF-κB decoy ODN或单纯注射脂质体则对视网膜的损伤性组织学变化无明显影响。

    2.3视网膜MPO活力的变化 中性粒细胞是数量最多的一种白细胞，其胞质的嗜天青颗粒中特异性地含有大量MPO，因此测定MPO活力能反映组织中的白细胞数量。B组视网膜的MPO活力高于A组，两者比较差异有统计学意义 (P <0.05，表1)。玻璃体内注射NF-κB decoy ODN的大鼠视网膜MPO活力下降，但仍高于A组(P <0.05，表1)。而玻璃体内注射错配NF-κB decoy ODN或单纯注射脂质体则无此作用(P > 0.05，表1)。

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