【摘要】  目的：研究SARS冠状病毒（SARS-CoV）S240蛋白与眼部功能性受体－血管紧张素转化酶2（ACE2）作用的机制。方法：构建SARS-CoV S蛋白融合基因pS240-EGFP，并在哺乳动物细胞中表达；半定量RT-PCR和免疫组化鉴定ACE2在结膜、角膜中的表达；酶联免疫吸附实验、流式细胞仪检测法进行SARS-CoV S240蛋白与结膜、角膜细胞的体外结合研究。结果：构建了融合基因pS240-EGFP；证实ACE2在结膜、角膜有表达；结膜、角膜细胞与SARS-CoV S240蛋白能够结合。 结论：结膜、角膜中存在SARS冠状病毒的功能性受体，SARS-CoV S240蛋白与结膜、角膜细胞能够结合。 本研究对了解SARS的病理机制及进一步研究SARS的防护和治疗具有一定的参考意义。

   【关键词】  严重急性呼吸综合征 冠状病毒 S240蛋白 受体 血管紧张素转化酶2 结合作用

    0引言

    非典型肺炎即严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome, SARS），具有高度传染性与致病性，其致病因子为一种新型冠状病毒－SARS冠状病毒（SARS-CoV），基因组结构为：5’-帽状结构-复制酶（rep）-棘突糖蛋白（S）-小包膜蛋白（E）-膜糖蛋白（M）-核衣壳蛋白（N）－多聚核苷酸(polyA)尾-3’。 S蛋白介导了病毒与宿主细胞的结合， SARS-CoV的功能性受体是血管紧张素转化酶2（angiotensin-converting enzyme 2-ACE2）。本研究用293T细胞表达出了包含SARS-CoV S蛋白结合功能区域的pS240-EGFP融合蛋白片段，体外培养了人结膜、角膜细胞，检测了SARS-CoV的功能性受体ACE2在人结膜、角膜中的表达，并进行了非洲绿猴肾细胞（Vero E6 Cell）、人结膜上皮细胞、结膜成纤维细胞和角膜上皮细胞与SARS-CoV S240-EGFP融合蛋白片段的体外结合实验研究。

    1材料和方法

    1.1材料  SARS-CoV S（基因组原型GenBank登录号为：AY278554）基因片段SⅠ（1～1 650nt）DNA片段。ACE2引物序列（accession number AF291820）：上游引物5’-CATTGGAGCAAGTGTTGGATCTT-3’，下游引物5’-GAGCTAATGCATGCCATTCTCA-3’，扩增片段长度为107个碱基。GAPDH: 上游引物5’-TGGGCTACACT GAGCACCAG- 3’, 下游引物5’-AAGTGGTCGTTGAGGG CAAT-3’，扩增片段长度为100个碱基。由上海博亚生物工程公司合成。PCR产物克隆载体pMD-18T（TaKaRa公司）；质粒pEGFP-N1（Clontech公司）；脂质体转染试剂Lipofectamine TMReagent（Invitrogen公司）； Mammalian Protein Extraction Reagent哺乳动物细胞蛋白抽提液（PIERCE公司）； SABC-AP免疫组化染色试剂盒（Santa-Cruz公司）；SARS患者恢复期血清（使用前经56℃加热30min进行灭活，获自北京小汤山医院与解放军309医院）。主要抗体：角蛋白Keratin Pan，波形蛋白Vimentin，神经纤维丝蛋白NF kappa B（上海友谊中联生物工程有限公司）；抗鼠辣根标记的二抗（上海华美生物工程有限公司）；羊抗人ACE2多克隆抗体（R&D公司）。组织来源：3～6mo中期引产胎儿的角膜、结膜、心、肺组织，男女不限；成人眼球破裂伤摘除的角膜和结膜组织；尸体解剖的成人心、肺、脑组织由长海医院提供。

    1.2 方法

    1.2.1 pEGFP-N1及pS240-EGFP融合蛋白的表达  PCR引物：SRF: 5'-GAATTCGCCACCATGCAGACCTCTAAT TTCAGGGTTG-3'（斜体为EcoRI酶切位点）；SRR: 5'-TCTAGATTAGGGATCCATCTCGAGAGGAGTTAACACACCA GTAC-3'（斜体分别为XbaI、BamHI、XhoI酶切位点）。基因工程方法构建真核表达质粒pMD-S240，进一步构建pS240-EGFP融合蛋白表达质粒。利用脂质体介导转染法将pEGFP-N1、pS240-EGFP分别转染293T细胞并进行克隆培养；细胞蛋白抽提液裂解细胞并进行透析，荧光分光光度计检测透析前后荧光光度值；Braford法检测蛋白质浓度；Western Blot法分析基因表达产物。

    1.2.2 ACE2在人结膜、角膜的表达  体外培养人结膜上皮细胞、角膜上皮细胞、结膜成纤维细胞并行ELISA法鉴定。抽提组织（或细胞）的总RNA，鉴定RNA纯度、浓度和完整性；半定量RT-PCR；琼脂糖凝胶电泳；经复日紫外及可见图像识别分析系统（上海复日科技公司）进行电泳条带光密度扫描，以光密度积分值比值ACE2/GAPDH代表mRNA的表达水平，实验重复3次，数据使用SAS软件包处理。免疫组化法检测组织、细胞中ACE2的表达（SABC法）

    1.2.3 S240-EGFP蛋白与各组织、细胞的结合  免疫酶标技术ELISA法：透析的各种组织及细胞蛋白抽提液与S240－EGFP蛋白进行结合试验，分别使用脑组织和Hela细胞及EGFP蛋白作为阴性对照，使用ACE2抗体进行阻滞研究。对所得的A 450值进行统计分析，使用SAS软件包，采用析因方差分析。流式细胞仪及荧光显微镜检测细胞与S蛋白的结合：检测结合后的荧光细胞。

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