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磁珠包裹的人视网膜色素上皮细胞受磁场牵拉后ET-1表达

http://www.cnophol.com 2008-12-23 11:17:11 中华眼科在线

   【摘要】  目的:探讨在体外RPE细胞受牵拉后内皮素(endothelin-1,ET-1)的表达。方法:用磁珠与RPE细胞粘和后,受磁场受力牵拉细胞的原理,用原位杂交、免疫组化和放射免疫测定法,检测牵拉对ET-1表达的影响。结果:在磁场中受力牵拉后,随着RPE受牵拉时间的延长,RPE形态发生改变,RPE细胞在各作用时间段后的24h ET-1表达明显,在细胞上清液中,ET-1含量也明显上升,作用10,30min和2h培养24h和48h的细胞调理液的ET-1含量与对照组均有统计学显著性差异(P < 0.05)。结论:RPE 细胞受牵拉后,ET-1表达和分泌增强,提示视网膜脱离发生过程中,会刺激表达ET-1增强。

   【关键词】 内皮素 视网膜色素上皮细胞

     0引言

    我们曾发现,在孔源性视网膜脱离(RRD)后玻璃体液中可检测出内皮素(endothelin-1,ET-1)[1]。视网膜脱离后,发生RPE和视网膜神经层的机械分离,是RRD发生和发展的关键环节。这一过程对RPE产生牵拉变形作用,对ET-1的表达是否有作用?RPE细胞是PVR形成的重要细胞,RRD过程中可能的牵拉、缺氧、炎前因子、失去正常的接触等因素中,已经证明缺氧、炎前因子等因素刺激RPE细胞ET-1的表达[2,3];而牵拉过程中,细胞变形对ET-1表达的影响尚无报道。我们通过一个机械牵拉模型模拟视网膜脱离前RPE细胞的状态,检测机械牵拉对RPE细胞表达ET-1的影响。

    1材料和方法

    1.1材料  从意外死亡的健康成年男性获取供体眼球,于死亡后24h内分离培养RPE细胞。参考王雨生等[4]方法,将眼球用含50mg/L庆大霉素的 D-Hanks’液冲洗2次,当细胞至3~6代后用于实验。DMEM-F12培养基(Costar公司),24孔培养板(Costar公司),ET-1原位杂交试剂盒,兔抗ET-1、SABC试剂盒,DAB试剂盒(博士德公司)。碘125-内皮素放射免疫分析试剂盒(北京免疫技术研究所)。实验所用磁珠(美国Aldrich公司), I型胶原(美国Sigma公司),矩形永磁铁(2.2cm×9.6cm×11cm)(西北有磁研究所制作)。

    1.2方法  将I型胶原加入0.1mol/L醋酸中,室温下搅拌1h至完全溶解,调节终浓度为1g/L的胶原溶液。在胶原溶1mL中加入磁珠0.4g,用100μLNaOH(0.1mol/L)调pH至7.4,于37℃孵育2h,胶原即吸附在磁珠上。磁珠悬液置于磁力架上,静置5min,使磁珠与溶液分离,弃去上清,加入PBS 1mL重悬,重复洗涤3次。最后在PBS中平衡24h。使用前混匀。以5×107/L的细胞密度接种无菌盖玻片平铺于24孔培养板中1mL 细胞悬液,置于50mL/L CO2孵箱中培养。加入包被胶原的磁珠,孵育40min,以PBS冲洗3次,加入磁场受力10,30min;20h,继续培养6,24,48h后,950mL /L酒精固定备用[5]。给细胞施加垂直方向磁场。磁场由一块矩形永磁铁产生,距离细胞培养板底2cm磁场强度为400 Gauss(G)(图1)。细胞在垂直力的作用下被拉伸,这个力是细胞表面的磁珠在磁场作用下所产生的,物镜位于细胞培养皿底部。

    图1 机械牵拉细胞模式图

    1.2.1受力后RPE的形态改变  RPE细胞粘附磁珠后,加入磁场受力10,30min;20h,观察RPE细胞受力后形态改变。

    1.2.2 RPE细胞ET-1表达  取已固定的细胞爬片,分别用原位杂交和免疫组化的方法检测RPE细胞对ET-1的表达。

    1.2.3调理液中ET-1含量  在上述细胞培养6,24和48h后,收集24孔板中细胞上清液,按放射免疫测定说明书,冻存于-20℃冰箱待用。按其放射免疫测定操作程序,检测在磁场作用不同时间和作用后不同时间段上清液中ET-1含量,按放射免疫测定步骤,使用美国Cap Rial 6型自动γ计数器检测,根据标准曲线直接计算ET-1含量。

    为定量分析在不同时间磁场作用下RPE表达ET-1的差异,应用LeicaQ5OOMC图像分析仪测定ET-1 mRNA 和ET-1在RPE细胞反应强度(平均黑度),每张照片任取5个RPE细胞的平均灰度值与背景平均灰度值的差值,进行单因素方差分析。

    统计学处理:采用SLM统计软件进行单因素方差分析,多组间的比较采用最小显著差法。作用组之间的相同观察时间的比较采用配对t检验。

    2结果

    2.1 RPE细胞牵拉后的表现 磁场作用前,包被磁珠的RPE细胞为较为圆的梭形、三角形和多边形,并伸出突起细胞间连接(图2A);磁场作用10min,细胞形态和密度没有明显的改变(图2B),作用30min,细胞变长,密度有所下降,但细胞连接变粗大,细胞尚饱满(图2C),作用2h和4h,除了细胞变稀疏外,少数细胞变圆,并有空泡,细胞进一步变细变长(图2D)。

    图2  粘附磁珠作用的RPE细胞(×400)。A:未加磁场;B:磁场作用10min;C:磁场作用30min;D:磁场作用2h

    2.2 RPE的ET-1的表达 牵拉10,30min;2h后,观察6,24,48h的细胞爬片免疫组化染色,在牵拉30min组和2h组,ET-1的表达逐渐加强,2h组除随时间表达增强外,RPE形态变长(图3,4)。免疫组化图片:磁场作用30min,F =25.181,P <0.01,培养24和48h与对照组有统计学显著性差异(P <0.05,0.01,图5)。原位杂交图片:磁场作用10,30min;2h,培养24h后,F =15.732,P < 0.01,30min和2h与对照组有统计学显著性差异(P < 0.01,图6)。

    2.3细胞调理液中ET-1的含量  经牵拉的细胞调理液,经放射免疫测定(表1):磁场作用10min,F= 5.754,P < 0.05,培养24h和48h与对照组有统计学显著性差异   (P <0.05,0.01)。磁场作用30min,F  =6.366,P <0.05,培养24h和48h与对照组有统计学显著性差异(P < 0.05,0.01)。磁场作用2h,F =6.96,P <0.05,培养24h和48h与对照组有统计学显著性差异(P <0.01,0.05)。作用组之间的相同观察时间用配对t检验比较均无统计学显著性差异。

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(来源:互联网)(责编:duzhanhui)

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