【摘要】  目的：探讨在体外RPE细胞受牵拉后内皮素（endothelin-1，ET-1）的表达。方法：用磁珠与RPE细胞粘和后，受磁场受力牵拉细胞的原理，用原位杂交、免疫组化和放射免疫测定法，检测牵拉对ET-1表达的影响。结果：在磁场中受力牵拉后，随着RPE受牵拉时间的延长，RPE形态发生改变，RPE细胞在各作用时间段后的24h ET-1表达明显，在细胞上清液中，ET-1含量也明显上升，作用10，30min和2h培养24h和48h的细胞调理液的ET-1含量与对照组均有统计学显著性差异（P < 0.05）。结论：RPE 细胞受牵拉后，ET-1表达和分泌增强，提示视网膜脱离发生过程中，会刺激表达ET-1增强。

   【关键词】 内皮素 视网膜色素上皮细胞

     0引言

    我们曾发现，在孔源性视网膜脱离（RRD）后玻璃体液中可检测出内皮素（endothelin-1，ET-1）[1]。视网膜脱离后，发生RPE和视网膜神经层的机械分离，是RRD发生和发展的关键环节。这一过程对RPE产生牵拉变形作用，对ET-1的表达是否有作用？RPE细胞是PVR形成的重要细胞，RRD过程中可能的牵拉、缺氧、炎前因子、失去正常的接触等因素中，已经证明缺氧、炎前因子等因素刺激RPE细胞ET-1的表达[2,3]；而牵拉过程中，细胞变形对ET-1表达的影响尚无报道。我们通过一个机械牵拉模型模拟视网膜脱离前RPE细胞的状态，检测机械牵拉对RPE细胞表达ET-1的影响。

    1材料和方法

    1.1材料  从意外死亡的健康成年男性获取供体眼球，于死亡后24h内分离培养RPE细胞。参考王雨生等[4]方法，将眼球用含50mg/L庆大霉素的 D-Hanks’液冲洗2次，当细胞至3～6代后用于实验。DMEM-F12培养基（Costar公司），24孔培养板（Costar公司），ET-1原位杂交试剂盒，兔抗ET-1、SABC试剂盒，DAB试剂盒（博士德公司）。碘125-内皮素放射免疫分析试剂盒（北京免疫技术研究所）。实验所用磁珠(美国Aldrich公司)， I型胶原（美国Sigma公司），矩形永磁铁（2.2cm×9.6cm×11cm）（西北有磁研究所制作）。

    1.2方法  将I型胶原加入0.1mol/L醋酸中，室温下搅拌1h至完全溶解，调节终浓度为1g/L的胶原溶液。在胶原溶1mL中加入磁珠0.4g，用100μLNaOH(0.1mol/L)调pH至7.4，于37℃孵育2h，胶原即吸附在磁珠上。磁珠悬液置于磁力架上，静置5min，使磁珠与溶液分离，弃去上清，加入PBS 1mL重悬，重复洗涤3次。最后在PBS中平衡24h。使用前混匀。以5×107/L的细胞密度接种无菌盖玻片平铺于24孔培养板中1mL 细胞悬液，置于50mL/L CO2孵箱中培养。加入包被胶原的磁珠，孵育40min，以PBS冲洗3次，加入磁场受力10，30min；20h，继续培养6，24，48h后，950mL /L酒精固定备用[5]。给细胞施加垂直方向磁场。磁场由一块矩形永磁铁产生，距离细胞培养板底2cm磁场强度为400 Gauss(G)（图1）。细胞在垂直力的作用下被拉伸，这个力是细胞表面的磁珠在磁场作用下所产生的，物镜位于细胞培养皿底部。

    图1 机械牵拉细胞模式图

    1.2.1受力后RPE的形态改变  RPE细胞粘附磁珠后,加入磁场受力10，30min；20h,观察RPE细胞受力后形态改变。

    1.2.2 RPE细胞ET-1表达  取已固定的细胞爬片,分别用原位杂交和免疫组化的方法检测RPE细胞对ET-1的表达。

    1.2.3调理液中ET-1含量  在上述细胞培养6，24和48h后，收集24孔板中细胞上清液，按放射免疫测定说明书，冻存于-20℃冰箱待用。按其放射免疫测定操作程序，检测在磁场作用不同时间和作用后不同时间段上清液中ET-1含量，按放射免疫测定步骤，使用美国Cap Rial 6型自动γ计数器检测，根据标准曲线直接计算ET-1含量。

    为定量分析在不同时间磁场作用下RPE表达ET-1的差异，应用LeicaQ5OOMC图像分析仪测定ET-1 mRNA 和ET-1在RPE细胞反应强度(平均黑度)，每张照片任取5个RPE细胞的平均灰度值与背景平均灰度值的差值，进行单因素方差分析。

    统计学处理：采用SLM统计软件进行单因素方差分析，多组间的比较采用最小显著差法。作用组之间的相同观察时间的比较采用配对t检验。

    2结果

    2.1 RPE细胞牵拉后的表现 磁场作用前，包被磁珠的RPE细胞为较为圆的梭形、三角形和多边形，并伸出突起细胞间连接（图2A）；磁场作用10min，细胞形态和密度没有明显的改变（图2B），作用30min，细胞变长，密度有所下降，但细胞连接变粗大，细胞尚饱满（图2C），作用2h和4h，除了细胞变稀疏外，少数细胞变圆，并有空泡，细胞进一步变细变长（图2D）。

    图2  粘附磁珠作用的RPE细胞（×400）。A：未加磁场；B：磁场作用10min；C：磁场作用30min；D：磁场作用2h

    2.2 RPE的ET-1的表达 牵拉10，30min；2h后，观察6，24，48h的细胞爬片免疫组化染色，在牵拉30min组和2h组，ET-1的表达逐渐加强，2h组除随时间表达增强外，RPE形态变长（图3，4）。免疫组化图片：磁场作用30min，F =25.181，P <0.01，培养24和48h与对照组有统计学显著性差异（P <0.05，0.01，图5）。原位杂交图片：磁场作用10，30min；2h，培养24h后，F =15.732，P < 0.01，30min和2h与对照组有统计学显著性差异（P < 0.01，图6）。

    2.3细胞调理液中ET-1的含量  经牵拉的细胞调理液，经放射免疫测定（表1）：磁场作用10min，F= 5.754，P < 0.05，培养24h和48h与对照组有统计学显著性差异   （P <0.05，0.01）。磁场作用30min，F  =6.366，P <0.05，培养24h和48h与对照组有统计学显著性差异（P < 0.05，0.01）。磁场作用2h，F =6.96，P <0.05，培养24h和48h与对照组有统计学显著性差异（P <0.01，0.05）。作用组之间的相同观察时间用配对t检验比较均无统计学显著性差异。

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