3讨论

     临床上许多视网膜脉络膜疾病的发生都与缺血缺氧密切相关。脉络膜局部长期缺血缺氧是AMD眼内CNV发生的主要原因之一[7,8]。CNV生成的机制尚未完全阐明，但RPE细胞和Bruch膜的损伤是诱发CNV的重要原因，Bruch膜及其周围基质的变化，改变了RPE细胞的基因表达，导致CNV发展[9]。在缺氧状态下，RPE细胞的多种氧反应基因上调表达，主要包括血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和转化生长因子(TGF)。实验性CNV中，RPE也可以产生VEGF、血管生成素(angiopoietin, Ang)和血管内皮受体Tie 1和Tie2[10]，通过自分泌和旁分泌作用于RPE使其增生[11,12]，进一步促进CNV的发展。由此可见，在CNV的过程中RPE细胞起着重要的调控作用，生长调节失衡是其中心环节，调节细胞生长平衡的改变，是一系列酶促反应的过程，又是调节以上各因子平衡的最后通路。

     PI3K是一种重要的细胞内蛋白激酶,当细胞受生长因子等刺激因子刺激后,细胞内PI3K活化，使其转化为3，4，5—三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3）[13]，并与其下游分子Akt结合，活化的PI3K/Akt可能通过TSC1/2复合物进一步激活其中下游分子Mtor[14]、eIF-4E结合蛋白1（4E-BP1）和核糖体蛋白P70S6K[15]，启动蛋白质的翻译[16,17]，因此磷酸化的PI3K被认为是蛋白质合成的主要信号调节通路，参与细胞增生、分化、移行等的调节[18]。PI3K可通过Akt、mTOR将有丝分裂信号传递给P70S6K，使细胞周期主要蛋白，如细胞周期素（cyclin）的翻译上调，促进G1期进展，使细胞周期加速[19]。在卵巢癌及前列腺癌中均发现，抑制PI3K活性可以降低cyclinD1、细胞周期依赖性蛋白激酶4（CDK4）的表达及Rb的磷酸化，导致细胞G1期阻滞，抑制细胞周期进展[19,20]。进一步证实PI3K信号通路在细胞增生与分化中发挥重要作用。

     我们研究发现，利用CoCl2建立RPE细胞缺氧模型8，12和24h后，RPE细胞进入S和G2/M比例随缺氧时间延长而增加（P＜0.01），说明CoCl2模拟的缺氧环境可以使RPE细胞周期加速，促进增生。RT-PCR和Western-blot结果提示，磷酸化PI3K在正常的RPE细胞中仅有微弱的表达，随着RPE细胞缺氧时间的延长，其表达水平逐渐升高。表明磷酸化PI3K表达与RPE细胞增生同步。这一结果与Zhou等[21]研究发现一致，即PI3K的磷酸化水平从正常乳腺上皮组织、不典型增生到肿瘤浸润渐次增加，PI3K的表达与增生呈正相关相，提示PI3K可能参与了RPE细胞增生的调节。

     LY294002因其具有较强的稳定性[22]，已经作为PI3K特异性抑制剂广泛应用于细胞生物学。LY294002处理RPE细胞后，FCS分析发现细胞增生受到了明显的抑制。进一步的细胞周期分析发现，抑制PI3K的状态下，S期细胞数量和增生指数在各时间点较对照组明显降低，进一步表明PI3K可能在缺氧诱导的RPE细胞增生中发挥着重要作用。

     致谢：本研究得到德国洪堡基金会（Alexander von Humboldt Foudation）仪器设备捐赠基金（V-8151/02085）资助，特此致谢！

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