【摘要】 建立体外培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞脂褐素形成模型, 为研究RPE细胞衰老过程中细胞结构及功能的改变以及由于其衰老而引起的一系列年龄相关性眼病如年龄相关性黄斑变性奠定基础。 方法：采用梯度离心法制备猪眼光感受器外节(POS)，将实验组RPE细胞与POS共培养3wk,在电镜下观察RPE细胞内脂褐素形成的形态学过程。 结果：RPE细胞与猪POS共培养后，POS脱落的膜盘逐渐被RPE吞噬并崩解，板层小体在溶酶体内形成，随着培养时间的延长，板层小体的数量增多；对照组细胞培养相同时间后细胞器形态没有明显变化，仅有少量板层小体形成，实验组较对照组RPE细胞脂褐素含量明显增多。 结论：将人RPE与猪POS共培养，促使了细胞内脂褐素的形成和蓄积，其过程周期短、操作简单、重复性强，可以作为体外培养的人RPE脂褐素形成模型。
引言
脂褐素(lipofucin)是细胞衰老过程中出现的具有特征性的物质，其含量增加反应了细胞老化的程度[1]。视网膜色素上皮(RPE)细胞内脂褐素的增加可导致细胞结构及功能的改变，并引起一系列年龄相关性眼病如年龄相关性黄斑变性(AMD)[2]。增加培养细胞传代次数可复制RPE衰老[3]，但实验周期长，也不能体现出RPE吞噬光感受器外节(POS)脱落的膜盘导致其结构及功能的改变，以致衰老死亡的特性。为了在体外模拟这一过程，我们用制备的猪眼POS与人RPE共培养，建立人RPE细胞脂褐素形成模型。
1材料和方法
1.1材料 POS的制备参照Hall[4]的方法。从屠宰场刚处死的猪获取供体眼球，4℃湿房保存，4h内进行视网膜的分离。在超净台内将猪眼球用750mL/L酒精浸泡消毒5min，无菌处理后将眼球角膜向上置于眼球托上，自赤道部环形剪开眼球壁，体视显微镜下小心将视网膜分离取出，移入D-Hanks溶液配制的2.5g/L胰蛋白酶(美国Sigma公司)中。将视网膜组织在冰上进行消化并用磁力搅拌器搅拌15min。将消化后的溶液移入干净的试管中0℃静置10min，待大块的视网膜组织沉淀后取上清液以3 000r/min离心10min。离心后的沉淀用D-Hanks溶液漂洗并再次离心，反复操作2次，将收集到的POS计数并分散于100mL/L胎牛血清DMEM/F12培养液(Gibco公司)，调整为2×1010个/L，用光镜、透射电镜观察进行鉴定。
1.2方法 采用胰蛋白酶消化法[5]体外培养的第2代人RPE细胞，以5×104个/L的密度接种于25mL培养瓶中，放在37℃，50mL/L CO2孵箱静置培养，次日更换培养液，以后隔天更换培养液，待细胞接近铺满时按1∶2进行传代并随机分为实验组和对照组。实验组细胞用含有POS的培养液培养3wk；对照组细胞用不含有POS的培养液在相同条件下培养相同的时间。将培养1，2，3wk的RPE用2.5g/L的胰蛋白酶消化，离心1 000r/min，5min×2次。弃去培养液，PBS溶液漂洗细胞3次，缓慢加入35g/L戊二醛，4℃过夜。送至电镜室，常规脱水，浸透，包埋，切片，染色，透射电镜观察和照相。
2 结果
2.1 POS的鉴定 倒置显微镜下观察，制备好的POS大小均一，形态类似，呈棒状均匀分布于培养液，其中散在少量细胞及杂质(图1A,B)。电子显微镜下观察，POS由胞质膜向内折叠构成了双层膜盘结构，除了与外节长轴相垂直的膜盘排列外，还可见到与外节长轴平行的膜盘以及斜形排列的膜盘(图2)。
A:×100; B:×400
图1倒置相差显微镜下制备的POS
图2电子显微镜下制备的POS×25 000
2.2RPE细胞脂褐素 透射电镜下观察对照组RPE的各细胞器清晰，游离核糖体丰富,分布均匀，粗面内质网排列规则，线粒体膜和嵴完整，高尔基体形态规整，核内染色质均匀。培养3wk以后，细胞内出现少量散在分布的电子密度均匀的均质小体和呈同心排列的板层小体，同文献报道的脂褐素的基本特征一致(图3)。实验组RPE用含有POS的培养液培养,电镜下可见尚未被吞噬的膜盘结构(图4A)以及正在被吞噬的膜盘(图4B)。3wk时可见核糖体颗粒模糊，分布紊乱；粗面内质网排列不规则，有膨胀和脱颗粒现象；线粒体数量减少，线粒体嵴断裂或消失；高尔基体扩张，形成低电子密度的空泡小体。细胞内出现大量高电子密度的均质小体和溶酶体，溶酶体内吞噬颗粒的周围形成多层次的板层结构(图4C)。均质小体和板层小体的数量较对照组细胞明显增多，且胞质内可见到尚未消化完全的膜盘结构(图4D)。
图3 对照组RPE细胞可见少量脂褐素小体（箭头）TEM×10 000
A: POS膜盘处于RPE细胞之间，尚未被吞噬TEM× 10 000；B: POS膜盘与RPE细胞接触，RPE胞膜表面内陷，将要吞噬膜盘TEM×15 000；C: 细胞内出现大量高电子密度的均质小体和溶酶体TEM×7 500；D: 胞质内尚未消化完全的POS膜盘结构TEM×15 000
图4 吞噬制备的POS的RPE细胞脂褐素形成TEM
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