3讨论

    正常人原代细胞经体外培养数代后最终都失去增殖活力，逐渐衰老死亡[6]。细胞衰老机制一直是人们研究的热点。脂褐素是一种脂质或蛋白质的聚合物，存在于不同组织有丝分裂后细胞的溶酶体内,它是溶酶体对细胞内结构或功能不健全的亚细胞成分进行自体吞噬后形成的残余物质，并随着年龄的增加而增多，因此又被称为“衰老色素”或“衰老标志”，它是整个细胞功能下降的一种生物学指标。对于RPE来说，脂褐素的形成则是由于RPE不断吞噬POS末端不断脱落的膜盘造成的。脂褐素作为被吞噬膜盘的不完全降解物堆积在RPE内，长期的堆积将严重影响细胞的功能，造成RPE的衰老及凋亡，进而引起一系列年龄相关性眼病如AMD的发生。据统计，一个80岁老人RPE中脂褐素的体积最终会占到胞质容积的19％[7]。因此，如果能在实验条件下使细胞内堆积脂褐素，找到一些重复性强的实验途径，成功的在年轻个体中形成脂褐素，甚至使细胞的寿命有所改变，那就会在解决脂褐素同衰老过程的关系问题上获得更多的线索。我们对培养的RPE内脂褐素的含量变化进行了观察，以脂褐素含量的增多作为细胞衰老的指标。

    我们将预先制备好的猪眼POS与人RPE共培养，用电镜记录细胞内脂褐素形成的过程。通过电子显微镜观察，Nunomura等[8]将脂褐素分为3型：I型由电子密度稍高的细微颗粒组成，可能含有空泡，即空泡小体；II型为均质无构造的团块，即均质小体；III型为板层结构，即板层小体。Heinsen[9]描述小脑脂褐素由3种成分组成：①小滴状均一的电子透明区；②颗粒状基质；③强嗜哦性小区。这三部分所占比例因细胞类型而异。在本实验中，对照组RPE培养3wk以后，细胞内出现少量散在分布的电子密度均匀的均质小体和呈同心排列的板层小体，其余细胞器结构并未发生较大变化，实验组细胞与POS共培养后出现细胞内脂褐素大量沉积，各种细胞器变性、分解，胞质内尚可见到未消化完全的膜盘结构。因此我们考虑对照组RPE细胞脂褐素的出现主要是由于年龄的内在因素造成脂褐素沉积，是溶酶体对细胞内结构或功能不健全的亚细胞成分进行自体吞噬后形成的，并不是实验处理使然。实验组细胞与POS共培养后出现细胞的变化与正常人RPE衰老后的改变极为相似，虽然其中也会存在因溶酶体自吞噬造成的脂褐素增多，但是与对照组相比，两组脂褐素含量的变化具有显著差异，因此我们认为造成该差异的原因主要是由于RPE吞噬POS引起的，这与体内RPE衰老后出现的脂褐素增多过程相一致。

    将制备好的猪眼POS与人RPE共培养，可以引起RPE因吞噬POS而造成的细胞内脂褐素的增多，模拟了人体内正常RPE的吞噬及衰老过程，因此可作为良好的RPE脂褐素形成的实验研究模型，为研究年龄相关性黄斑变性的发病机制奠定了基础。

   【参考文献】

1 Terman A, Brunk UT. Lipofuscin. Int J Biochem Cell Biol ,2004;36:1400-1404

2 Boulton M, Dayhaw-Barker P. The role of the retinal pigment epithelium: topographical variation and ageing changes.Eye ,2001;15:384-389

3韩泉洪,贾洪真,郭长梅,王静波,张鹏,崔志利,惠延年.培养人视网膜色素上皮细胞中β一半乳糖苷酶活性研究.眼科研究,2004;22:456-458

4 Hall MO. Phagocytosis of light-and dark-adapted rod outer segments by cultured pigment epithelium. Science ,1978;202:526-528

5王雨生,严密,杨抚华.视网膜色素上皮细胞培养技术及其应用.中华眼底病杂志,1994;10:124-128

6徐国兴,杨娟,孙堂胜,胡建章,谢茂松,郭健.体外原代培养人视网膜色素上皮细胞.国际眼科杂志,2004;4(1):12-15

7 Feeney-Burns L, Hilderbrand E, Eldridge S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular,equatorial and peripheral cells. Invest Ophthalmol Vis Sci ,1984;25:195-200

8 Nunomura A, Miyagishi T. Ultrastructural observations on neuronal lipofuscin (age pigment) and dense bodies induced by a proteinase inhibitor, leupeptin, in rat hippocampus. Acta Neuropathol (Berl) ,1993;86:319-328

9 Heinsen H. Lipofuscin in the cerebellar cortex of albino rats: an electron microscopic study. Anat Embryol (Berl) ,1979;155:333-345

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