【摘要】 目的：探讨钙通道拮抗剂—维拉帕米（verapamil，Ver）对体外培养的人视网膜色素上皮（human retinal pigment epithelium,hRPE）细胞凋亡诱导作用及凋亡过程中细胞内钙浓度[Ca2+]i的变化。方法：应用80mg/L的Ver作用体外培养hRPE细胞12，24及48h，采用吖叮橙（AO）荧光染色法、透射电镜、流式细胞术观察hRPE细胞凋亡；Fluo-3/AM负载技术，观察凋亡过程中细胞[Ca2+]i的变化。结果：一定浓度Ver可诱导hRPE细胞凋亡，荧光显微镜及电镜观察hRPE细胞具有早期凋亡特征：核荧光呈黄绿色，电镜下核染色质浓染、边集。流式细胞术显示，Ver作用后的hRPE细胞凋亡百分率增加（F ＝12.3415，P ＜0.05）。Ver作用的hRPE细胞内钙浓度（[Ca2+]i）呈下降趋势（F ＝23.607， P ＜0.01）。 结论：Ver能诱导体外培养的hRPE细胞凋亡，细胞内[Ca2+]i浓度的变化可能是诱导hRPE凋亡的机制之一。
0引言
增殖性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreo retinopathy，PVR）是孔源性视网膜脱离的常见并发症和手术失败的主要原因，尽管玻璃体视网膜手术技术不断提高，但复发率并未改善[1] ，同时玻璃体切割手术本身就是诱导PVR形成的一个危险因素[2]。RPE细胞的迁移、增殖可启动PVR的形成，而细胞内Ca2+的升高是RPE细胞增殖的危险因素[3]。Ver是一种可靠的慢钙通道阻滞剂，能阻止细胞外钙内流，在PVR发生中对RPE细胞增殖起着重要调节作用[4]。本研究应用一定浓度钙通道阻断剂Ver，作用于体外培养hRPE细胞，诱导其凋亡并观察凋亡过程中细胞内[Ca2+]i的变化。
1材料和方法
1.1材料 流式细胞仪（B.D公司），DIAGNOSTIC INSTRUMENTS-SPOT INSIGH荧光摄像（USA）系统及MetaFluo4.5/coolsnapfx/IX70细胞内钙离子荧光成像（USA）测定系统。DMEM培养基(Gibco)、新生牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)、胰蛋白酶(1∶250 Difco，Gibco)、维拉帕米（verapamil，Ver）、二甲基亚砜（DMSO）、吖叮橙（AO）、A23187均为美国Sigma公司产品；Fluo-3/AM荧光探针（Eugene Oregon, USA）；其它试剂均为国产分析纯。采用胰蛋白酶消化法[5]。在无菌状态下，取角膜移植后的供体眼球（供体年龄限制24～38岁），在无菌PBS液中沿角巩膜缘后2mm处环形剪开，弃去眼前节及玻璃体，自视盘处分离视网膜神经上皮层，加入2.5g/L胰酶消化混合液，于37℃消化1h，加入含200mL/L新生牛血清DMEM的培养液，用吸管吹打RPE细胞面使细胞脱落，将含RPE细胞的液体移入离心管中，离心1 000r/min×8min，弃上清后，加入培养液，调整细胞密度1×105/L，将RPE细胞悬液接种于6孔板内，37℃，50mL/L CO2孵箱中培养。RPE传代培养同文献[6]，3～6代细胞用于本实验。
1.2方法 将第3代的hRPE细胞种植于内置盖玻片的24孔板中，加入Ver 80mg/L，作用12，24，48h后，取出玻片，与未加药的对照组，投入950mL/L乙醇中固定30min，微干，10mL/L醋酸作用30s，1×10-4吖啶橙（AO）染色1min，0.1mol/L氯化钙处理2min。PBS漂洗3次。且用PBS封片，荧光显微镜下直接观察，每孔重复3次。在4℃条件下离心，收集80mg/L Ver作用12，24，48h后及未加药的hRPE细胞5×106个/L，加入等量25g/L戊二醛固定，离心5min，弃去上清，移至离心管中，加入25g/L戊二醛固定，4℃作用30min。常规电镜固定包埋，柠檬酸铅染色，透射电镜上观察，摄片。以80mg/L浓度的Ver，作用12，24，48h后，收集2×106/L个细胞，离心1 000r/min×5min，PBS漂洗1次。离心去PBS，加入PI染液0.5mL，4℃避光作用30min。荧光染色剂PI用氩离子激发荧光，激光发光波长488nm，流式细胞仪采集数据，cellquest分析软件分析，通过计算凋亡区（亚二倍体区）细胞数量得出凋亡率。每个样本重复3次。将1×105/L细胞接种于3.5cm2的一次性培养皿中，待细胞80%融合后，加入终浓度80mg/L的Ver，作用12，24，48h，换液后，加入无血清DMEM液体1mL，加入终浓度10μmol/L FLUO-3/AM染色，37℃，50mL/L CO2孵箱内孵育45min，PBS充分洗去染料，室温静置15min后，置于MetaFluo4.5/coolsnapfx/IX70细胞内钙离子荧光成像测定系统操作台上，25℃测定单个细胞钙荧光强度，激发波长488nm，40倍物镜观察，每组计算20个单个细胞钙离子浓度，取其均值。加入A23187 5μmol测定最高荧光强度值， 加入0.2mmolMnCl2测定最低荧光强度值，细胞内钙浓度按[Ca2+]i＝Kd（Fmax-F）/（F-Fmin）公式计算，Kd＝400，Fmax为最强荧光值，Fmin为最低荧光值，F为测得细胞荧光值。
统计学处理：采用方差分析进行统计学检验，统计过程均用SPSS10.0软件进行，数据用x±s表示。
2结果
2.1 AO染色结果 在荧光显微镜下，未加药组AO染色的HRPE细胞呈梭形，细胞质呈红色荧光，细胞核呈绿色均匀荧光，可见深染细胞核核仁（图1）。 经80mg/L Ver作用后，可见凋亡细胞呈圆形，体积明显缩小，细胞核内可见致密浓染的黄色荧光（图2）。Ver作用48h后的凋亡细胞数量比24h的明显增多，贴壁细胞明显减少。而作用12h的细胞与未加药组细胞比较无明显变化。
图1 正常hRPE细胞呈梭形，细胞质呈红色荧光，细胞核呈绿色均匀荧光，可见深染细胞核核仁 AO×200
图2 Ver作用hRPE细胞48h，细胞呈圆形，体积明显缩小，细胞核内可见致密浓染的黄色荧光 AO×200
2.2透射电镜结果 正常hRPE细胞超微结构见细胞核膜完整，染色质均匀分布。Ver作用12h后，细胞超微结构与未加药组无明显差异。作用24h时凋亡的细胞在电镜下可见：细胞核内出现染色质边集及染色体固缩，电子密度增强，细胞体积变小，细胞浆浓缩，其内细胞器保存较好，细胞浆内可见空泡增多，细胞膜保存完整，可见细胞膜芽生出泡现象。48h时可见核染色质浓缩和细胞膜芽生出泡（图3）。
图3 Ver作用48h的HRPE细胞，电子密度增强，核膜凹陷，染色质浓缩，边集TEM×6 700
2.3流式细胞仪检测结果 Ver作用12h时，G0/G1期前可亚二倍体峰，24，48h亚二倍体峰逐渐增高。根据流式细胞仪显示G0/G1期前的亚二倍体区所占百分率计算凋亡率，Ver作用12，24，48h的凋亡率（%）分别为8.21±1.20，16.14±4.60，23.93±3.63，组间比较，差异有显著性意义（F＝12.3415， P＜0.05）,随着时间的延长，凋亡率逐渐增加。
2.4 hRPE细胞[Ca2+]i变化 荧光图像显示，正常HRPE细胞显示Ca2+荧光分布，胞核荧光最强，胞质次之（图4，5）。Ver可降低hRPE细胞内[Ca2+]i,正常hRPE细胞及Ver作用hRPE细胞12，24，48h时细胞内[Ca2+]i（nmol/L）分别为197.25±29.03、176.09±25.88，156.45±20.60，135.28±21.18，组间比较，具有显著性差异（F＝23.607，P＜0.01)。
图4正常HRPE细胞钙荧光，见细胞内钙荧光，胞核荧光强，胞核次之Fluo-3/AM×400
图5A-C 分别为Ver作用12，24，48h时hRPE细胞钙荧光像，可见钙荧光强度逐渐减弱Fluo-3/AM×400
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