2结果

    2.1光镜检查 光镜下正常大鼠视网膜结构与人视网膜结构相似，有完整的10层结构。视网膜各层结构清晰，排列整齐，外颗粒层细胞最多，非常致密，神经节细胞层细胞最少，大小不一，呈圆形或椭圆形，分单层或多层排列(图1)。再灌注后2d，生理盐水注射组可见视网膜神经节细胞丢失，排列稀疏，囊样变较明显（图2A）。7d组视网膜神经节细胞光学改变与2d组类似（图2B）。PEDF注射治疗组2d时神经节细胞层较生理盐水2d及7d注射组均明显增厚，细胞数量明显增多，细胞排列较紧密，仅见少量囊样变（图2C）。PEDF治疗后7d，视网膜神经节细胞层跟对照组相比细胞排列均匀整齐，较致密，囊样变现象不明显（图2D）。

    2.2 FAS原位杂交分析 抗FAS阳性染色均位于细胞质内，呈棕黄色，细丝状，分布不均匀，细胞核呈灰蓝色。凋亡细胞阳性信号为覆盖整个细胞核的深蓝色着色及细胞质的棕黄色着色。生理盐水注射组，视网膜缺血—再灌注2d， FAS原位杂交图片显示较多阳性染色的视网膜神经节细胞，散在分布，胞体较正常略大（图3A）; 7d组也可见阳性染色细胞，但数量较2d组较少（图3B）。PEDF治疗组，视网膜缺血—再灌注2d，仍然可见散在阳性染色细胞，数量较生理盐水组明显减少（图3C）；再灌注7d，阳性细胞虽偶然可见，大部分切片中未发现阳性细胞(图3D)。

    2.3视网膜神经节细胞计数 再灌注2d时缺血—再灌注生理盐水注射组（15.4±6.8）和PEDF注射组（23.8±7.4）视网膜神经节细胞明显少于正常对照组（36.3±10.5）， (t =4.71, P <0.01)和(t =2.72, P <0.05)；PEDF注射组视网膜神经节细胞数较生理盐水注射组明显较多，相比有显著性差异（t =2.38, P <0.05）。再灌注7d后结果与2d时类似。2.4大鼠视网膜神经节Fas阳性细胞数 再灌注2d生理盐水注射组Fas阳性染色细胞比PEDF注射组明显较多（P ＜0.05， 表1）；再灌注2d生理盐水比PEDF注射组之间阳性细胞百分率明显较高（P <0.01，表1）

    图1 正常大鼠对照眼视网膜，箭头为神经节细胞层HE×40

    3讨论

    临床上目前尚未发现治疗缺血—再灌注造成的视网膜神经节细胞损伤的有效的方法。眼睛是机体中一个相对独立的解剖结构，而血—视网膜屏障又成为全身及眼球表面用药使药物释放入眼内的主要屏障。而经玻璃体腔注射药物即可穿过该屏障，迅速作用于靶器官—视网膜以达到快速有效治疗的目的。本实验即利用了这一原理，通过该途径探讨了PEDF对缺血—再灌注视网膜损伤的保护作用。早在1952年Smith 等[8]就利用前房加压灌注制作眼缺血—再灌注模型，之后经过多年的重复和改良后被广泛使用[2，4，9]。此法目的是增加眼球内容物的体积，压迫视网膜血管，使视网膜微循环压力升高。正常状态下视网膜循环压力低于体循环舒张压，故视网膜血液持续灌流，当眼内压升高使视网膜循环压力等于甚至高于体循环压时，视网膜血流中断，导致视网膜缺血，此方法引起的视网膜缺血彻底，对动物创伤小，可重复性强。本组

    24只大鼠均达到了理想的眼内压，经过检眼镜及显微镜检查亦确定了视网膜血流的中断及缺血状态的存在，为实验的顺利进行打下了良好的基础。缺血—再灌注损伤不仅发生在心肌缺血—再灌注时，在其他器官，如脑、胃肠道、肾、肝、视网膜等均可发生缺血—再灌注损伤。视网膜组织主要成分为神经组织，视网膜的中央动脉为终末动脉，因此，视网膜缺血和循环障碍可以导致视网膜的严重损伤。

    视网膜缺血后可引起视网膜一系列分子生物学改变和病理改变。临床上常见的青光眼即是由于眼内的压力异常增高并持续一定时间所导致的视神经的损坏，它和其它所有视神经疾病共有一个特征，即视网膜神经节细胞的进行性死亡。大量高眼压动物实验中对视网膜神经节细胞的病理光镜和电镜显示，正在死亡的细胞所展示的许多特征与已知的凋亡相一致。Quigley等 [10] 用TUNEL法来辩识猴实验性青光眼神经节细胞中的DNA片段，结果显示TUNEL阳性的视网膜神经节细胞至少是对照眼的10倍，有力地支持了青光眼视网膜神经节细胞的死亡是凋亡，并且有实验显示该凋亡在模型建立后6h内即有发生[11]。我们发现，视网膜缺血—再灌注2d生理盐水注射组可见神经节细胞的严重细胞丢失，细胞密度降低、囊样变以及FAS阳性染色细胞明显增多。随着再灌注后时间的延长神经节细胞密度未见明显变化但FAS 阳性染色细胞明显减少，说明细胞的凋亡是视网膜缺血-再灌注早期神经节细胞死亡的主要方式[12]。Fas 是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)受体和神经生长因子(nerve growth　factor，NGF) 受体家族的细胞表面分子，Fas 配体(Fas ligand，FasL)是TNF家族的细胞表面分子。Fas 分子为典型的型膜蛋白，胞内段存在传递死亡信号的死亡域。FasL与其结合后，通过死亡域传递细胞死亡信号，引起Fas表达的细胞凋亡。已有研究表明眼角膜全层FasL表达阳性，视网膜神经细胞也表达FasL阳性，视网膜色素上皮细胞呈弱表达[13]。我们应用Fas的这一分布以及表达特性，确定了高眼压视网膜缺血—再灌注模型中与Fas相关神经节细胞的凋亡存在以及PEDF对该凋亡的明显抑制Ｇ作用。对视网膜缺血—再灌注损伤的治疗原则是在缺

    血—再灌注发生后尽早进行细胞保护，防止再灌注损伤的发生。我们应用具有神经保护作用的色素上皮源性因子（PEDF）进行一定量眼内注射，目的在于减轻视网膜缺血—再灌注对视网膜神经节细胞的损伤。PEDF是Steele等[5]从人胎儿视网膜色素上皮细胞（RPE）体外培养液中分离，提纯出来的。它是一种可溶性糖蛋白，相对分子量 46 000。PEDF是唯一的一种神经营养功能的丝氨酸蛋白水解酶抑制因子超基因家族。它广泛存在于全身许多组织，在眼中多个组织中也广泛分布，在眼球内玻璃体腔中的浓度很高。目前对PEDF 在眼组织内的表达和作用的研究结果证明它在早期视网膜脉络膜新生血管眼内的表达增高[14]并且与血管内皮生长因子（VEGF）的存在呈负相关性[15，16]，表明PEDF在脉络膜新生血管生成过程中起着抑制作用 。 Ogata等[15]通过采集增殖性糖尿病性视网膜病变玻璃体并进行PEDF 和VEGF的含量测定发现，PEDF的含量明显低于VEGF的含量并提示这种负相关对眼内增殖性病变也起着重要作用。PEDF除了抑制新生血管及增殖性病变外，还可诱导细胞凋亡[17]。它能够诱导体外培养的血管内皮细胞凋亡，也能促进活体缺血视网膜内皮细胞的凋亡。而我们则是利用了PEDF的神经保护、营养作用探讨其在缺血性视网膜损伤中的作用。Cayouette 等[18]证实了PEDF在光感受器形态发生中的重要保护作用。之后Taniwaki等[19]也发现PEDF对短期高眼压引起的缺血—再灌注视网膜损伤有部分保护作用。PEDF的生物学特性以及其在眼内组织中的活跃状态，激发了人们利用它的神经保护作用和眼局部应用的安全性进行进一步的研究以解决眼科临床上相关眼病。

    已有研究证明，给大鼠玻璃体腔内预先注射微量腺病毒介导的色素上皮源性因子，在大鼠视网膜再灌注7d后观察发现，PEDF注射组视网膜厚度及神经节细胞密度明显高于未注射组[20]，证明PEDF 对视网膜缺血—再灌注损伤有抑制作用。本实验结果表明，视网膜缺血—再灌注后立即行眼球内PEDF注射在再灌注后2d及7d时神经节细胞的计数较对照组明显增多(P <0.05)，FAS免疫染色阳性细胞数却较对照组明显减少（P <0.01）。然而在两组再灌注后7d时FAS阳性细胞数及阳性率却没有明显差异。该结果进一步证实了PEDF 对视网膜缺血—再灌注早期损伤具有一定的保护作用，而晚期视网膜的改变则可能以神经节细胞的变性、坏死为主的理论[1]。

    视网膜缺血—再灌注后又可以诱发机体以及眼局部自身的代偿保护机制，例如：热休克蛋白HSP70mRNA的高表达[21]以及机体抗氧化系统的活化等[22]，而这些自身保护因子的作用又可以减轻或延缓这种眼压升高而引起的视网膜缺血—再灌注损伤，因此，再灌注后视网膜神经节细胞形态及功能的恢复并非单一保护因子的作用。由于两实验组2d和7d时RGC计数相比无明显差异，由此推测可能存在多种因子对RGCs的保护作用。众所周知，神经营养因子的保护作用有剂量依赖性，需要重复使用才可以达到长期的神经保护作用[23]。因此寻求一种长期有效的治疗方法及途径，是今后研究工作的重要方向。由于本实验条件有限，尚未涉及到视网膜缺血—再灌注模型动物PEDF干预后对视功能的影响，不同剂量PEDF对眼内组织有无毒性作用及在眼内存留时间，干预后在眼组织内分布等，还有待在今后的实验中进一步研究以早日为广大青光眼患者及各种疾病引起的视神经的损伤提供可靠而有效的治疗方法。

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