【摘要】 目的：探讨眼睑基底细胞癌组织中p53基因的表达。方法: 收取武汉大学人民医院病理科1999～2006年收集的手术切除及活检的基底细胞癌( basalcell carcinoma,BCC)标本共40例，另取癌周围组织5例作对照。基底细胞癌发病年龄20～68岁。根据细胞分化程度,将BCC分为分化型(角化型、囊样型、腺样型)和未分化型(实体型、色素型、浅表型、硬化型) ,其中BCC分化型22例,未分化型18例。将基底细胞癌和正常组做免疫组织化学染色，观察各组细胞内p53基因表达的变化。利用HPIAS-2000图像分析系统测定p53基因在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果：基底细胞癌组织中p53基因呈高表达，癌旁组织中p53基因呈低表达。图像分析结果显示，基底细胞癌组织与癌旁组织之间p53基因的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.01)。结论：p53基因在肿瘤的发生发展中起了重要的作用。

    【关键词】  眼睑 基底细胞癌 p53基因

　　眼睑基底细胞癌(basal cell carcinoma, BCC) 是眼睑恶性肿瘤中最常见的一种，虽然其发病缓慢，恶性程度和转移性较低，但发病人数的逐年增多，已引起人们高度重视。研究显示，多种癌基因的异常表达在眼睑BCC的发生发展过程中有着重要作用。研究癌相关基因在BCC 发生、发展及转移机制中的作用，对于揭示BCC 的生物学行为与探索有效的防治方法具有重要意义。
    
　　P53基因有野生型(wild-typep53,wtp53)和突变型(mutant-typep53,mtp53)两种,wtp53可参与细胞周期的调控,在维持细胞增长、抑制肿瘤增殖过程中起重要作用。当其转变为mtp53时,则失去对细胞生长的抑制作用,促进细胞转化和过度增殖,导致肿瘤的发生［1，2］。
    
　　本实验采用免疫组织化学方法观察了p53基因在眼睑基底细胞癌组织中的表达,探讨p53基因在眼睑基底细胞癌组织中的作用机制，旨在为临床上进一步探讨眼睑基底细胞癌发生、发展的确切机制提供理论依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  标本来源  收取武汉大学人民医院病理科1999～2006年收集的手术切除及活检的基底细胞癌( basalcell carcinoma,BCC)标本共40例，另取癌组织周围正常组织5例作对照。基底细胞癌发病年龄20～68岁。根据细胞分化程度［2］ ,将BCC分为分化型(角化型、囊样型、腺样型)和未分化型(实体型、色素型、浅表型、硬化型) ,其中BCC分化型22例,未分化型18例。所有标本均经10%甲醛固定, 常规HE染色，光镜观察，病理检查确诊。

　　1.1.2  主要试剂 
    
　　浓缩型兔抗人p53多克隆抗体（北京中山生物技术有限公司）；超敏即用型S-P通用型免疫组织化学试剂盒（福州迈新生物有限公司）；显色试盒及多聚赖氨酸（北京中山生物技术有限公司）。

　　1.1.3  主要仪器  YWY781型医用微波仪（250 W，50 Hz），浙江临安电子器材厂生产；家用高压锅。

　　1.2  方法

　　1.2.1  常规HE染色  取材、固定、脱水、透明、切片和HE染色。

　　1.2.2  免疫组织化学S-P法检测p53抗原  主要步骤：组织切片5μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗；3%过氧化氢，37℃孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×5min；p53采用微波抗原修复（3档，10 min），PBS洗4×5min；正常羊血清37℃孵育10 min以减少非特异性反应；一抗37℃孵育1 h，PBS洗4×5min；生物素标记的二抗，37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应；苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照。
 
　　1.3  免疫组织化学结果判断 
    
　　p53相关抗原以胞膜或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照除细胞核染成蓝色外，胞核和胞浆内无棕黄色反应物。
    
　　采用HPIAS-2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对p53的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。
    
　　（阳性面积率＝单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100％）

　　1.4  统计学处理
    
　　对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNK-q检验，检验水准α为0.05。

　　2  结果
    
　　基底细胞癌组织内可见癌细胞胞浆或胞核内密集分布的棕黄色颗粒， p53基因表达强；癌旁组织细胞胞浆内可见少量的棕黄色颗粒，p53基因表达弱。图像分析结果显示：基底细胞癌p53基因表达的平均光密度为0.2953±0.0182，癌旁组织p53基因表达的平均光密度为0.1043±0.0089；基底细胞癌p53基因表达的阳性面积率为0.3012±0.0126；癌旁组织p53基因表达的阳性面积率为0.1751±0.0098。经单因素方差分析，组间有显著性差异（P＜0.01）。经q 检验，基底细胞癌与癌旁组织之间，p53基因的平均光密度及阳性面积率有显著性差异(P＜0.01），见表1。

　　表1  基底细胞癌与癌旁组织p53基因表达的平均光密度和阳性面积率（略）

　　注：* 基底细胞癌与癌旁组织比较， P＜0.01。

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