谢汉平 王向军

第三军医大学全军眼科中心 重庆 400038

目的

本试验首先连续递增地切除不同范围兔眼角膜缘干细胞组织，通过眼表形态学变化，角膜上皮印迹细胞学观察及组织病理学改变，确定角膜缘干细胞移植时健眼取材的安全范围。并且通过角膜组织病理、透射电镜超微结构变化和免疫组化观察探讨纤维蛋白粘合剂 (fibrin sealant，FS) 行无缝线角膜缘干细胞移植治疗LSCD的可行性，为临床应用奠定实验基础。

方法

1. 按30°、60°、90°等依次递增至210°,分组切除兔眼角膜缘干细胞组织建立模型。2. 通过裂隙灯显微镜观察各组角膜混浊、上皮荧光染色及角膜新生血管3项临床指标，角膜上皮印迹细胞学检查及HE染色观察角膜上皮的细胞表型和组织病理学变化，确定角膜缘干细胞健眼取材的安全范围。3. 建立兔眼角膜缘干细胞部分缺损模型，并随机分为纤维蛋白粘合剂组和常规缝线组对兔眼行自体角膜缘干细胞移植。手术三天后每天行角膜荧光素染色观察两组兔眼角膜上皮愈合时间；术后7天、14天、30天通过裂隙灯显微镜检查观察角膜混浊和新生血管生长情况。4. 术后14、30天裂隙灯显微镜观察两组兔供眼角膜混浊、上皮荧光染色及角膜新生血管情况。5. 通过HE染色观察术后7天、14天、30天三个时间点FS组和缝线组兔眼角膜组织病理变化。通过免疫组织化学方法观察两组角膜上皮特异性角蛋白K3以及P63蛋白的表达。移植术后30天，透射电镜观察角膜的超微结构变化。

结果

1. 兔眼角膜缘切除范围大于150°时，角膜出现混浊、上皮持续缺损、新生血管长入及结膜上皮向角膜内生长等干细胞失代偿表现，临床指标评分比较有显著差异（P＝0.000<0.01）。2. 在出现角膜缘干细胞失代偿的兔眼角膜上皮印迹细胞学检查中，可见PAS染色阳性的结膜杯状细胞。3. FS组角膜上皮愈合时间比缝线组短（P＝0.044<0.05），FS组在抑制角膜新生血管方面优于缝线组，有统计学差异（P＝0.043<0.05）。4. 移植术后7天，FS组和缝线组角蛋白K3表达明显低于正常对照组（P<0.01）， FS组角蛋白K3表达的IOD值高于缝线组（P<0.05），而术后14、30天FS组和缝线组与正常角膜间未见统计学差异（P>0.05）。5. 术后7天、14天，FS组与缝线组角膜P63蛋白表达量明显增加，与正常兔眼角膜P63蛋白表达的IOD值比较均有非常显著的差异（P<0.01），而FS组与缝线组之间P63蛋白表达的IOD值未见统计学差异（P>0.05）。

结论

1.角膜缘干细胞移自体植健眼的取材范围≤150°（相当于5个钟点位）是安全的。角膜缘干细胞切取范围＞150°可能出现不可逆的角膜缘干细胞失代偿。2. 纤维蛋白粘合剂行无缝线自体角膜缘干细胞移植治疗角膜缘干细胞缺损是可行的。具有良好生物相容性和降解性，可以减轻炎症反应，减少角膜新生血管形成。3. 纤维蛋白粘合剂不影响角膜缘干细胞的增殖，不影响角膜缘干细胞移植片生长。