高明宏 栾阿丹

沈阳军区总医院眼科

目的 建立以羊膜为载体兔角膜缘上皮细胞的体外培养方法，了解其生物学特性，为最终实现以体外培养的兔角膜缘干细胞移植提供实验依据。

方法 选择新鲜的兔眼球，在净化台内，用含有“双抗”的生理盐水进行冲洗后，制备兔角膜缘组织，将其剪切成约1mm×1mm大小的组织块。以去除上皮细胞的羊膜为载体，采用三种方法对兔角膜缘上皮细胞（limbal epithelial cell ,LEC）进行接种培养，分别为：组织块直接接种培养法、组织块制备单细胞培养法、组织块经酶消化处理后培养法。培养基分别采用了RPMI-1640和DMEM＋Ham-F12，并添加了相同的营养因子。倒置显微镜下观察培养细胞体外生长的形态。

结果 1、组织块直接接种培养法：接种培养第3天，上皮细胞开始从角膜缘组织块周围移行到羊膜上，形成典型的“沙滩样”移行带。第5～7天，大部分组织块上的细胞从移行带向外生长形成生长晕，相互连接成膜状。第13～15天，细胞汇合在一起，排列紧密，铺满整个羊膜。2、组织块制备单细胞培养法：培养接种 5天后上皮细胞开始在羊膜上贴壁，细胞呈圆形，大小一致。第8天左右细胞开始生长，2周时细胞汇合在一起，形成网状结构。同时，生长的上皮细胞中有成纤维样细胞的混杂生长，但各自保持其良好的细胞形态。 3周左右形成良好的单层，细胞生长呈膜片状扩展，整个羊膜之上铺满细胞，有明显的扩展界限。但羊膜之上有两种细胞混合生长，成纤维细胞的生长明显强于上皮细胞。3、组织块经酶消化处理后培养法：培养第7天，部分上皮细胞开始在羊膜上贴壁，但大多以散在形式生长。在部分细胞贴壁的同时，培养液中有悬浮生长的细胞，换液后仍然存在。第15天，羊膜上贴壁的细胞逐渐增多，但大多数以单细胞生长，也可见少量的细胞团。第20～25天左右，培养的细胞汇合在一起，形成团状结构，逐渐成网状后连接成片，但不能形成良好的单层。

结论 1、羊膜是兔LEC体外培养的良好载体。2、在以羊膜为载体的三种接种培养方法中（①组织块直接接种培养法；②组织块制备单细胞培养法；③组织块经酶消化处理后培养法），组织块直接接种培养法效果最佳。3、以RPMI-1640和DMEM+ Ham-F12（体积比3：1）为培养基培养兔LEC，在培养基中添加相同的营养成份，培养结果无明显差异。