【摘要】 目的: 利用VEGF的变化映射早产儿视网膜病变新生血管的发生发展过程。方法:建立缺氧小鼠新生血管动物模型,实时定量PCR检测小鼠视网膜VEGF在不同时间点的mRNA值，通过函数绘制VEGF与新生血管的拟合曲线，并求得VEGF映射视网膜新生血管的函数方程。结果:通过实验和数学推算，我们获得VEGF映射视网膜新生血管的线性方程。 结论: 利用VEGF的mRNA表达,可以建立方程映射视网膜新生血管的发生发展，为下一步研究奠定基础。
【关键词】 VEGF；映射；视网膜；新生血管
Preliminary research of VEGF mapped ROP neovascularization
Bin Li1, YanHui Li2, LingJuan Xu1, KaiLuo Hua3
Foundation items: National Natural Science Foundation of China (No. 30672278, 30872823); Natural Science Foundation of Hubei Province (No. 2007ABA108)
1 Department of Ophthalmology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China; 2 School of Mathematic and Computational Science, Sun YatSen University, Guangzhou 510275, Guangdong Province, China; 3 Department of Gastroenterology, Zhongshan Hospital, Wuhan 430033, Hubei Province, China
AbstractAIM: To map the development and progression of retinopathy neovascularization of prematurity by the changes of VEGF.
METHODS: Animal model of high oxygen inducing retinal neovascularizaton was established. The mRNA level of VEGF in mice retinal at different time points was assayed by real time PCR. Then we drew the Fitting curve of VEGF and angiogenesis by function, access to function equation of VEGF mapped retinal neovascularization.
RESULTS: We get Linear equations of VEGF to map retinal neovascularization.
CONCLUSION: We can create equations to map retinal neovascularization by mRNA expression level of VEGF and lay the foundation for further study
KEYWORDS: VEGF; map; retina; neovascularization
Li B, Li YH, Xu LJ, et al. Preliminary research of VEGF mapped ROP neovascularization. Int J Ophthalmol(Guoji Yanke Zazhi)2008;8(11):2187
0引言
早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity, ROP)是一种严重的致盲性眼病,发生于未成熟或低体重出生婴儿的视网膜,新生血管的出现是ROP的主要特征,在ROP的病变过程中,新生血管从无到有,这一事件的发生是一个复杂的过程,有很多生长因子参与,我们拟利用生长因子描述新生血管的发生发展,但将所有的生长因子来描述目前很困难,也不能准确刻画生长因子与新生血管的对应关系,我们在前面的研究证实生长因子具有冗余性,即有些生长因子的部分功能是重叠的,因此,我们可以选取一个具有代表性的因子描述新生血管的发生发展。研究表明血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是其中的关键因子和中心环节[1,2],VEGF直接促进新生血管的形成,并贯穿新生血管形成和发展的全过程,本研究以VEGF为切入点,利用VEGF在高氧诱导鼠视网膜中的变化映射新生血管的发生发展过程,为从整体理解和研究这一病理过程进行初步的探索。
1材料和方法
1.1材料 出生7d 的C57BL/6N小鼠(50～100g),雌雄兼有,与哺乳母鼠共同饲养,系清洁动物,由华中科技大学同济医学院动物中心提供;Hot star Taq Polymerase试剂盒(Qiagen公司,德国);SYBR GreenⅠ荧光染料(ABI公司,美国);Trizol Reagent Kit RNA提取试剂盒（基因公司，中国香港）。
1.2方法
1.2.1动物模型的建立 出生7d的C57BL/6N小鼠42只随机分为7组,第一组6只鼠作为对照组,另外6组放入一端位进气孔,另一端为出气孔的密闭容器内,进气孔通以流量为1.5L/min 氧气,出气孔接氧浓度测量仪,每天测量氧浓度5次,控制室温23±2℃,容器保持氧浓度75%±2%,日光照明,5d后返回空气环境饲养。
1.2.2实验分组 根据实验要求分7个时间点,分别于小鼠出生后7,10,12,12.5,13,14,17d,每个时间点取一组（6只小鼠）的视网膜组织，RealtimePCR检测VEGF的表达变化。
1.2.3 RealtimePCR 建立标准PCR反应体系,加入SYBR GreenⅠ荧光染料(ABI公司,美国),采用Hot star Taq Polymerase试剂盒(Qiagen公司,德国)，第一步95℃ 表1高氧诱导鼠视网膜中VEGF/betaactin的比值(n=6)
在氧箱中出生后7d10d出氧箱12d12.5d13d出现新生血管14d新生血管达高峰17d0.87±0.050.56±0.040.6±0.040.85±0.060.93±0.101.2±0.120.86±0.08
保温15min以激活Hotstar Taq Polymerase的活性。在循环过程中，在第三步72℃, 实时收集FAM/Sybr荧光信号，经过30循环后72℃保温10min，然后进行融解曲线的分析。引物为：Beta actin：上游引物:CTG GGT ATG GAA TCC TGT GG；下游引物:TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG；VEGF:上游引物:TCT TCA AGC CGT CCT GTG TG，下游引物:ACA GTG AAC GCT CCA GGA TTT A。退火温度为58℃。
1.2.4 VEGF拟合方程 利用函数将VEGF的值绘制曲线并拟合成线性方程，映射小鼠体内新生血管从无到有的变化过程。
统计学处理: 组间VEGF/betaactin值以均数±标准差( ±s)表示,各组均数比较采用成组t检验,以P≤0.05为差异有显著性统计学意义。
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