阴正勤
    第三军医大学西南眼科医院，重庆　400038

    视网膜变性疾病是严重的致盲眼病，主要有视网膜色素变性(Retinitis Pigmentosa, RP) 和年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration, AMD)。目前还没有治疗方法能有效阻止视网膜变性的进展和恢复视网膜变性疾病患者的视功能。视网膜干细胞的研究提供了潜在治疗途径。本研究的目的是分离和培养一种新来源的视网膜干细胞，并展开系统的研究。通过分离和培养大鼠尾芽胚视杯视网膜干细胞，在认识其体外生物学特性的基础上，结合移植后细胞的存活、迁徙、分化特性和RCS大鼠视网膜功能变化，探讨视杯来源视网膜干细胞潜在的研究和应用前景。

    本研究取得的主要结果和结论如下：

    1、Long Evans大鼠胚期视网膜干细胞的分布。对胚龄12.5-14.5天（E12.5d- E14.5d）的大鼠胚胎视杯组织做连续水平位冰冻切片，抗Chx10 及视网膜细胞标志蛋白免疫组化染色。结果显示，Chx10在胞浆中表达，E12.5d视杯组织中，Chx10阳性细胞主要分布在视杯内层、外层和边缘层，在视杯内层呈复层上皮状，多呈三角形、圆形、椭圆形，呈放射状排列，与视杯内外层切面垂直，在视杯内层和外层交界处呈簇状分布，Thy1.1免疫组化染色阴性。表明，E12.5d胚胎视杯中视网膜干细胞丰富，未见分化细胞出现，是取材获得的胚期视杯来源视网膜干细胞的理想时期。

    2、Long Evans大鼠尾芽胚期(E12.5d)视杯来源视网膜干细胞的分离、培养和鉴定。分离大鼠尾芽胚(E12.5)视杯细胞，用无血清培养法建立体外培养体系。研究了培养过程中的形态变化，克隆形成能力，细胞增殖能力，并进行了视杯来源的视网膜干细胞的纯化和鉴定。结果表明，从E12.5d视杯中分离和培养的细胞增殖能力强、具有自我更新能力，和向多种成熟视网膜细胞分化的潜能，是视杯来源的视网膜干细胞（OC-RSCs）。该细胞在传代三代以后可高度纯化，因此，OCRSCs是易于纯化、分化确切的视网膜干细胞。

    3、视杯来源的视网膜干细胞（OC-RSCs）的生物学特性。结果表明，不同浓度的胎牛血清对OC-RSCs分化的影响不同，低浓度胎牛血清诱导OC-RSCs主要向GFAP 的阳性细胞分化，而表达视杆细胞特异性抗原rhodopsin的阳性细胞数较少，提高胎牛血清浓度，分化出现的GFAP阳性细胞比例呈下降趋势；2.5%胎牛血清诱导OC-RSCs分化成rhodopsin阳性细胞的比例最高。RA和VEGF可作为一种有效的诱导因子定向诱导OC-RSCs向感光细胞分化，其中RA的作用更强。

    4、OC-RSCs视网膜下腔移植后的存活、迁徙、分化以及对受体大鼠视网膜mERG的影响。E-GFP基因转染实验表明外源基因可在视杯视网膜干细胞中良好表达。将转染EGFP的OC-RSCs移植到RCS大鼠和Long Evans大鼠视网膜下腔后用激光扫描共聚焦显微镜观察移植后1周、2周、3周、4周EGFP转染细胞的存活、迁徙和分化为感光细胞的情况。发现E-GFP转染视杯视网膜干细胞行视网膜下腔植入后，能在Long Evans大鼠视网膜下腔和感光细胞层的外层内存活，但迁徙现象不明显；而移植入RCS大鼠视网膜下腔的E-GFP转染的视杯视网膜干细胞能在视网膜感光细胞层内存活和迁徙到视网膜各层；两种动物的移植术眼，都可在视网膜锥杆细胞层内观察到rhodopsin阳性细胞，在后者视网膜内表达rhodopsin细胞数量较多。提示变性视网膜较健康视网膜更有利于视杯视网膜干细胞的迁徙，这可能是移植后宿主视网膜mERG变化的原因之一，为视网膜变性疾病的治疗提供了新的思路和途径。

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