【摘要】目的：研究原发性开角型青光眼（POAG）相关的异常单核苷酸多态性（SNP）位点和等位基因，以便早期基因诊断和早期筛选POAG高危人群。
方法：应用ABI Prism 7500HT型荧光定量PCR仪结合TaqMan SNP Genotyping试剂盒荧光探针技术检测POAG9例，POAG伴高度近视9例，和正常对照100例IL6，IL6R，多巴胺受体D2（DRD2），β纤维蛋白原（FGB），过氧化物酶体增殖物激活受体γ2（PPARG），转化生长因子β1（TGFβ1），和E选择素（ESel）基因的单核苷酸多态性位点。
结果：POAG和POAG伴高度近视患者呈多达5～6个位点的SNP改变，包括IL6R，DRD2和FGB基因的错义表达。其中1例POAG伴高度近视患者呈现唯一的DRD2 A等位基因和唯一的IL6R基因错义表达SNP。同时，POAG和POAG伴高度近视患者表现多个SNP等位基因的异常频率。
结论：IL6，IL6R，PPARG，ESel，TGFβ1，FGB和DRD2基因的SNP在POAG的发生与发展中起着相关联的作用。其中，DRD2的SNP基因类型可能与POAG伴高度近视有关。
【关键词】 原发性开角型青光眼 高度近视 单核苷酸多态性
青光眼的分子遗传学研究目前尚处于初始阶段。虽然已经定位和克隆了一些位点和致病基因，但由于青光眼发病机制不同、临床类型各异，这增加了基因定位、基因克隆和功能鉴定的复杂性。临床上表现为不同类型的青光眼可由同一致病基因引起，如阿克森费耳德里德尔综合征1型和IRID2与PITX2基因；但有时分子上定位于染色体同一位点不同类型的青光眼却不是同一致病基因引起的，如均位于6ｐ25的IRID1和ARA；同一基因可以引起不同的临床特点或综合征，如PAX6基因［1］。从而给临床分型和基因分型造成冲突。青光眼是多基因性疾病，受许多对微效加性基因作用。这些不同基因构成的遗传背景中，可能有易感性主基因起着重要作用。同时还受环境因素的制约，彼此间相互作用错综复杂，所以任一基因的多态性对疾病发生仅起微弱的作用［2,3］。鉴于此，我们对原发性开角型青光眼（POAG）相关基因的单核苷酸多态性（SNP）进行分析，发现与POAG相关的异常SNP位点，以利于阐明POAG的发病机制，早期基因诊断和早期筛选POAG高危人群，特别是伴有高度近视的患者。
1对象和方法
1.1对象 200510/200605中山大学中山眼科中心青光眼专科确诊的POAG患者18例，全部经过Goldmann多次眼压，Humphrey 750型自动视野，海德堡2.01型共焦激光断层扫描仪和前房角镜检查。伴高度近视者，经自动验光仪检查和小瞳验光，确定屈光度数和矫正视力。POAG诊断标准参考1987年全国青光眼学组推荐的标准［4］。1）眼压 > 21mmHg （Goldmann 压平眼压测量）；2）青光眼性视盘生理凹陷扩大（C/D >0.6或双眼差 >0.2）；3）青光眼性视野损害；4）视网膜神经纤维层缺损；5）前房角检查为宽角。对照病例为广州市第十二人民医院体检的健康者，无眼病史和青光眼家族史。POAG组9例（男7，女2），年龄28.9（14～54）岁，起病年龄15～36岁；均无近视家族史，屈光度数值 ≤3.00D；患眼矫正视力无光感～1.5，青光眼性视野损害早期～晚期，眼压28～50mmHg (Goldmann)。高度近视合并POAG组9例（男4，女5），年龄34.8（23～55）岁，起病年龄20～50岁；其中4例有高度近视家族史，近视屈光度数值 ≥8.00D；患眼矫正视力眼前手动～1.5，青光眼性视野损害早期～晚期，眼压25～60 mmHg (Goldmann)。正常对照组100例（男47，女53），年龄58.3（50～70）岁。
1.2方法 通过计算机网上检索中国期刊全文数据库（CNKI）和“外文生物医学期刊全文服务系统”（http://192.168.2.10:8080/fmjs/index.jsp），库内已发表的相关文献作为资料来源。选出与POAG相关的因子：白介素6，白介素6受体，多巴胺受体D2，β纤维蛋白原，过氧化物酶体增殖物激活受体γ2，转化生长因子β1，和E选择素及相应的单核苷酸多态性序列号（dsSNP ID）［3-9］（表1）。通过GenBank的dbSNP数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/）和TSC（The SNP Consortium）数据库（http://snp.cshl.org/）查询，得到相关基因的SNP、位置、和错义翻译（表1）。抽取静脉血1.5mL，25g/L EDTA抗凝。基因组DNA抽提采用基因组DNA小量抽提试剂盒(上海生工生物工程公司提供)，对实验方法作适当的修改。所得DNA样本20℃保存。应用ABI Prism 7500HT型荧光定量PCR结合TaqMan SNP Genotyping试剂盒荧光探针技术进行检测，实验结果由随机附带软件作出等位基因分布图后判断。实时定量PCR采用ABI Prism 7500HT型荧光定量PCR仪。PCR反应体系为25μL，包括2×Universal PCR Master mix 12.5μL；40×Probe/Primer mix 0.625μL；ｄATP，ｄCTP，ｄGTP，ｄUTP共1μL；加水10.875μL。Primer/Probe Mix含6FAM 探针（200nmol/L），VIC探针（200nmol/L），正向引物（900nmol/L），和反向引物（900nmol/L）。FAM与VIC探针分别对应于两种多态或正常与突变基因（表2）。PCR循环条件：预变性50℃ 2min → 95℃10min后，92℃ 30s → 60℃ 60s，进行40个循环。每次检测至少设3个空白对照。读取PCR后的终点荧光信号，应用SDS软件v1.0数据分析。检测结果的荧光分布表现为：图谱中的每一个x代表一个标本，X轴代表VIC探针荧光，Y轴代表FAM探针荧光，原点处为空白对照，对角线处为杂合子。根据图谱，选择对应的等位基因类别，显示基因分型结果。
统计学处理：用SPSS11.5软件包进行分析。基因型和等位基因频率采用基因直接计数法计算，各组间基因型及等位基因频率比较采用卡方检验，P<0.05为有统计学意义。
2结果
通过TSC数据库查询，得到的POAG相关基因SNP位点的亚洲人群各基因类型频率（表3）和等位基因频率（表4）。
表1 POAG相关基因的序列号，位置和错义翻译（略）
表2 实时定量荧光PCR的探针序列（略）
表3 各亚洲人SNP的基因类型频率（略）
表4 各SNP的亚洲人等位基因频率（略）
2.1 SNP的等位基因频率 DRD2的A等位基因仅见于POAG伴高度近视组。POAG组未见IL6R的C和ESel的T等位基因。在POAG组及POAG伴高度近视组，IL6的C等位基因频率（55.6%，22.2%）显著高于正常组（4.0%）和亚洲人（6.8% ～ 2.3%）；TGFβ1的A等位基因频率（11.1%）略低于正常组（21.0%）和亚洲人（46.3% ～ 47.7%）。POAG组中DRD2和FGB的G等位基因频率（66.7%）分别显著和略高于POAG伴高度近视组（22.2%，44.4%）；PPARG的C等位基因频率（44.4%）略高于POAG伴高度近视组（11.1%），正常对照组（15.0%）和亚洲人群（16.3%，表5）。
2.2等位基因频率和错义表达 POAG组内同时DRD2和FGB出现错义表达的占44.4%（4例），而POAG伴高度近视组仅11.1%。POAG组内同时表现5个位点SNP的占33.3%（3例），而POAG伴高度近视组为44.4%（4例）。有1例POAG伴高度近视患者呈现唯一的DRD2 A等位基因和唯一的IL6R基因错义表达SNP（表6）。
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