【摘要】目的：探讨重组人白介素1受体拮抗剂对培养的胎儿晶状体上皮细胞黏附和增殖的影响。方法：培养晶状体上皮细胞，取生长良好的第2代细胞用于实验。将第2代胎儿LEC于不同浓度的rhIL1ra孵育后，用四甲基偶氮唑盐(methylthio tetrazole, MTT)法记录各孔黏附细胞数量的吸光度（A）值,并与空白组进行对照;将第2代胎儿LEC培养24h待细胞贴壁后，与不同浓度的rhIL1ra再共育24h后，MTT法记录各孔细胞数量的吸光度（A）值,并与空白组进行对照。结果：除1μg/L浓度组外，其余各组抑制胎儿晶状体上皮细胞与胶原的黏附呈剂量依赖性，与空白组对照具有显著性差异。100μg/L浓度组细胞收缩、变圆，但仍保持贴壁状态，与空白组对照可显著抑制已贴壁胎儿晶状体上皮细胞的增殖。结论：有＞1μg/L的各组rhIL1ra能够抑制体外培养的胎儿LEC与胶原的黏附，并且浓度越大抑制作用越明显,具有浓度依赖性。仅100μg/L rhIL1ra浓度组作用24h可显著地抑制已贴壁胎儿晶状体上皮细胞的增殖，但仍保持贴壁状态，提示该药可能具有较轻的毒副作用。
【关键词】 白细胞介素1受体拮抗剂；晶状体上皮细胞；抑制；胎儿
Modulation of rhIL1ra on fetus lens epithelial cells attachment and proliferation
XiaoHeng Li, Li Qin, YangSheng Peng, WenJun Zhao, Jing Li
1Department of Ophthalmology, Boai Hospital, Xian 710065, Shaanxi Province, China; 2Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Xian Jiaotong University, Xian 710061, Shaanxi Province, China
Correspondence to:XiaoHeng Li. Department of Ophthalmology, Boai Hospital, Xian 710065, Shaanxi Province, China. [email protected]
Abstract AIM: To investigate the influence of interleukin1 receptor antagonist (rhIL1ra) on fetus lens epithelial cells (LEC) attachment and proliferation. METHODS: Antiadhesion experiment: The 2nd passage LEC suspended in DMEM/F12 medium were preincubated for 30 minutes in the presence of various concentration of rhIL1ra, then, inoculated in 96well plate coated with gelatin. After incubation for 8 hours, the attached cells in each well were determined by the value of absorption (A) of 3(4,5dimethylthiazolzyl)2, 5diphenyl tetrazodium bromide(MTT). Antiproliferative experiment: Twentyfour hours after the 2nd passage of LEC was incubated in 96well plate at 37℃, 50mL/L CO2, they were exposed to different concentrations of rhIL1ra. Twentyfour hours later, the number of cells was determined by MTT method. RESULTS: Except 1g/L group, LEC from attaching to gelatin was in a dosedependent manner in other goups, and the ID50 was 50g/L. Compared with controls, only 100g/L of rhIL1ra could significantly inhibit the proliferation of the attached LEC at 24 hours.CONCLUSION:In vitro, rhIL1ra (>1g/L) can significantly inhibit the attachment of LEC to gelatin, and IL1ra inhibition effect was dosedependent. After the attached LEC were exposed to different concentrations of IL1ra for 24 hours, only 100g/L can inhibit the proliferation, but can not make the attached LEC suspend, this possibly indicates IL1ra may have lower side effects.
KEYWORDS: interleukin1 receptor antagonist; lens epithelial cell; fetus; inhibition
0引言
后发性白内障是白内障术后影响人们远期视力的主要原因。晶状体后囊膜混浊的主要原因是白内障囊外摘除术后，晶状体前囊下和赤道部残留的晶状体上皮细胞向后囊迁移、生长增殖并纤维化生所致。因此，选择一种安全有效、毒副作用小的药物，是后发性白内障药物防治中的关键问题。我们探讨重组人白细胞介素1受体拮抗剂在晶状体上皮细胞黏附、移行、增殖过程中的作用，为临床后发性白内障的防治开辟新途径。
1材料和方法
1.1材料
依据世界卫生组织（WHO）、联合国教科文组织（UNESCO）生物伦理委员会（IBO）等的要求，按照“知情同意和知情选择”原则，于2004年，摘取水囊引产死亡时间不超过6～8h的5～8mo的胎儿眼球，用冰筒保存，送入实验室，现取现用，取生长良好的第2代细胞用于实验。DMEM/F12培养基和胰蛋白酶（美国Gibco公司）、新生牛血清（杭州四季青生物材料研究所）、四甲基偶氮唑盐(methylthio tetrazole, MTT)（Sigma公司）、二甲基亚砜（dimethyl sulfone, DMSO)（广州新港化工有限公司）、注射用青霉素钠（山东鲁抗医药有限公司）、注射用硫酸链霉素（大连美罗制药厂）。CO培养箱 、自动酶标读数仪、倒置显微镜及照相系统 、超净工作台 、微量加样器、液氮罐 、分析天平、医用高压锅 、微量震荡器 、电热恒温水浴箱。
1.2方法
胎儿眼球放入无菌小烧杯中，用庆大霉素稀释液（1∶1000）浸泡，冰壶保存及时送回实验室。组织块培养法原代培养晶状体上皮细胞。取生长良好的第2代细胞用于实验。体外培养人LEC，生长刚融合时，用传代培养的方式悬浮细胞，4g/L台盼蓝鉴定细胞活性，调活细胞密度为1×108个/L，分装入5个试管中。随机分组，实验组（I~IV组），加入IL1ra，其中浓度分别为1,10,50,100μg/L。对照组加入等体积的基本培养液。实验组及对照组同时置于37℃、50mL/L CO2培养箱中，30min后，振荡各试管，将各试管中的细胞悬液接种于涂有明胶的96孔板中，每组8复孔，100μL/孔。96孔板置于37℃、50mL/L CO2培养箱中孵育8h，吸除上清，用基本培养液轻洗各孔2次，去除未贴壁细胞，每孔加完全培养液100μL和5g/L的MTT染液10μL，继续培养3h后，吸去培养液，每孔加入100μL DMSO。37℃放置10min。然后用酶标仪测每孔570nm波长下的A值。吸收值越大，黏附细胞越多。以上实验重复4次。取第2代细胞，用2。5g/L胰蛋白酶溶液消化后，吹打成细胞悬液，低速离心机离心，1000r/min，8min，弃上清液，收集上皮细胞，用基本培养基调整细胞浓度为1×108个/L，将细胞悬液接种于涂有胶原的96孔板中，100μL/孔。培养24h后弃去培养液，实验I~IV组中加入IL1ra，浓度同上，对照组加入等体积的基本培养液。实验组和对照组再培养24h，加入等体积的5g/L的MTT染液10μL。继续培养3h后，吸去培养液，每孔加入100μL DMSO。37℃放置10min。用酶标仪测每孔570nm波长下的A值。实验重复3次。
统计学处理： 数据以±s表示，实验数据采用 SPSS 11.0软件分析，用单因素方差分析比较各组之间有无显著性差异。
2结果
2.1倒置显微镜观察
组织块培养24h即有细胞自块周爬出(图1A)，3d细胞明显增多，细胞属贴附型上皮样细胞，细胞无色，呈多角形，折光性强(图1B)。6～8d贴壁细胞生长活跃，细胞集团增加(图1C)。融合成片的细胞互相分离，约11～13d可布满培养瓶底壁（图1D）。
2.2白介素
1受体拮抗剂抗黏附的结果 MTT法显示，IL1ra能够抑制胎儿眼晶状体上皮细胞与胶原的黏附，且呈剂量依赖性，随着浓度的增加，A值逐渐减小，实验I组与对照组之间没有显著性差异P=0.496>0.05，实验II,III,IV组与对照组的贴壁数比较有显著性差异，并且浓度越大，抑制作用越明显，具有浓度依赖性。IL1ra体外抑制细胞黏附的半数有效量（ID50）为50μg/L（表1）。
2.3白介素
1受体拮抗剂抗增殖的结果 传代细胞接种后24h，细胞已全部贴壁并进入增殖期。加入不同浓度的IL1ra后，实验IV组细胞开始收缩、变圆，但仍保持贴壁状态，与对照组相比P=0.001，具有显著抑制已贴壁细胞增殖的作用。其余各组与对照组相比无显著性差异（表1）。表1 rhILra对胎儿眼晶状体上皮细胞黏附和增殖的影响（略）
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