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　　HIF-1α特异性siRNA对缺氧状态下RPE细胞表达VEGF的抑制

　　张鹏,王雨生,惠延年,王海燕,胡丹,马吉献

　　第四军医大学西京医院眼科 全军眼科研究所 710032

　　视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium ，RPE）细胞对血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor ，VEGF）高表达导致脉络膜新生血管（choroidal neovascularization ，CNV）生长。在缺氧状态下，缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor –1,HIF-1) 与VEGF的高表达有关，它是VEGF最主要的转录因子。HIF-1由α亚基和β亚基组成，HIF-1α的表达受缺氧诱导，是HIF-1的活性中心。目的：利用RNAi技术研究针对HIF-1α的特异性siRNA下调缺氧状态下HIF-1α表达的可能性，以期降低HIF-1对VEGF的转录激活，为临床治疗CNV疾病提供新的思路与方法。

　　方法：缺氧环境中培养传代的人RPE细胞，用RT-PCR半定量分析及免疫荧光抗体染色检测RPE细胞内HIF-1α  mRNA及蛋白的表达，用免疫组化法及ELISA检测试剂盒检测RPE细胞及其培养液内VEGF蛋白的表达。设计、合成针对HIF-1α mRNA 序列的siRNA，将其与mU6pro载体连接,将该表达载体经脂质体介导转染入人RPE细胞。用RT-PCR半定量分析及免疫荧光抗体染色检测转染HIF-1α特异性siRNA表达载体后RPE细胞内HIF-1α mRNA 及蛋白的表达状况。用免疫组化法及ELISA分别检测转染HIF-1αsiRNA表达载体后的RPE细胞及其培养液内VEGF蛋白的表达。对照组RPE细胞内转染mU6pro空载体。

　　结果：免疫荧光染色显示，缺氧30min时RPE细胞胞浆内即有荧光出现。随着缺氧时间的延长， RPE细胞核荧光胞核荧光染色。缺氧4h时，细胞核荧光最为明亮。RT-PCR半定量分析显示，缺氧30min时HIF-1α mRNA即有表达，缺氧4h时HIF-1α mRNA表达最为显著（P <0.01）。ELISA证实，培养液内VEGF蛋白含量随缺氧时间的延长明显增加，在缺氧8h时达高峰（P <0.01）。HIF-1α siRNA表达载体被成功构建后经转染进入RPE细胞内。RT-PCR半定量分析显示， HIF-1α mRNA在siRNA转染后RPE细胞中的表达水平为0.25±0.19, 在空载体对照组RPE细胞中的表达水平为1.79±0.38。较空载体对照组，siRNA转染组HIF-1α mRNA的表达水平显著降低（P﹤0.01）。免疫荧光染色证实， siRNA转染组及空载体对照组RPE细胞均未有荧光染色。免疫组化及ELISA证实， siRNA转染后RPE细胞及其培养液内VEGF蛋白的表达水平均下调，而空载体对照组有VEGF蛋白表达仍增强。

　　结论：缺氧上调RPE细胞内HIF-1α mRNA及蛋白的表达，促使HIF-1发生核转移发挥转录作用，激活RPE细胞表达VEGF，这可能是缺氧诱导CNV生成的重要原因。针对HIF-1α 的特异性siRNA可抑制RPE细胞内HIF-1αmRNA及蛋白的表达，显著下调其对VEGF的表达，本研究结果有望为临床基因治疗CNV提供新的突破口。

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