青光眼             1028                                      PO0443

　　大鼠慢性高眼压模型视网膜胶质病理改变及其在RGCs损伤中的作用

　　凌志红，孙兴怀

　　复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科  200031

　　研究目的

　　通过建立稳定的大鼠慢性高眼压模型，研究青光眼视网膜胶质细胞病理改变及其在视网膜神经节细胞损伤中的作用。
                   
　　主要研究方法及内容

　　1.用结扎上巩膜静脉联合术后球结膜下注射5-Fu的方法建立大鼠慢性高眼压模型。

　　2.在模型建立后2小时、12小时、1天、1周、4周、8周，分别取4只高眼压组、假手术组及正常组大鼠眼球，冰冻切片行免疫组织化学染色，在激光共聚焦显微镜下观察视网膜GFAP表达的情况。

　　3.在模型建立后2小时、12小时、1天、1周、4周、8周，分别取4只高眼压组及正常大鼠分别在视网膜铺片上进行GFAP染色,，行星型胶质细胞计数并观察其形态。

　　4.在模型建立后2小时、12小时、1天、1周、4周、8周，分别取4只高眼压组、假手术组及正常大鼠鼻侧一半视网膜，在铺片上行OX42染色，进行小胶质细胞计数并观察其形态；取剩余的颞侧中周部视网膜，半薄切片行甲苯胺蓝染色进行Müller计数。

　　5．在模型建立后1月，作眼球冰冻切片，行免疫组织化学染色，在激光共聚焦显微镜下观察视网膜TNF-α-GFAP、TNF-α-OX42 、TNFR-1-GFAP以及TNFR-1-NeuN的双标染色情况。

　　主要研究结果

　　1．结扎上巩膜静脉联合术后球结膜下注射5-Fu可诱导较长时间稳定高眼压，10周内130只眼中有112只眼眼压大于22 mmHg，成模率为86.15%；眼压升高1周、4周、6周、10周后，视网膜神经节细胞的存活率分别为：90.16%, 83.50%, 75.01%, 62.37%。

　　2．高眼压模型建立后2小时，就有活化的小胶质细胞出现，一周后活化的小胶质细胞数量达到高峰，以后逐渐减少。

　　3．高眼压模型建立后12小时，星型胶质细胞以及Müller细胞开始呈现活化状态，4周后两者的活化达到高峰，以后逐渐下降；并且活化的星型胶质细胞在结构上有明显异常。与正常组相比，慢性高眼压组视网膜星型胶质细胞以及Müller的数量没有明显变化。

　　4．TNF-α、GFAP抗体的免疫组化双标染色：正常大鼠视网膜内界膜下、神经节细胞层的星型胶质细胞GFAP染色呈弱阳性，整个视网膜未见明显TNF-α阳性染色，1个月高眼压大鼠除视网膜内界膜下、神经节细胞层星型胶质细胞GFAP染色增强外，其余各层也可见丝条状贯穿于内外界膜之间的GFAP阳性染色，其形状与Müller细胞的形状相似，并且在上述部位有GFAP及TNF-α的共表达。

　　5．TNF-α、OX42抗体的免疫组化双标染色：正常大鼠视网膜小胶质细胞有OX42的微弱表达，胞体小，分支细、长，主要分布于视网膜神经节细胞层、神经纤维层、内核层以及内丛状层，整个视网膜未见TNF-α阳性染色；1个月高眼压大鼠视网膜小胶质细胞OX42染色变深，胞体变大，分支变粗，但分布仍主要位于视网膜神经节细胞层、神经纤维层、内核层以及内丛状层，并且在上述部位有OX42、TNF-α的共表达。

　　6．TNF-R1、GFAP抗体双标染色:正常大鼠视网膜未见明显TNF-R1染色；在慢性高眼压情况下，TNF-R1在视网膜内层的表达较正常对照组增加，并且在视网膜内层，TNF-R1与 GFAP有共表达。
 
　　7.TNF-R1、NeuNIgG抗体双标染色：正常大鼠视网膜未见明显TNF-R染色；同样，在慢性高眼压情况下，TNF-R1在视网膜内层的表达较正常对照组增加，但TNF-R1与神经节细胞层NeuN（神经元特异性核蛋白）没有共表达。

　　结论

　　1．结扎上巩膜静脉联合术后球结膜下注射5-Fu诱导的慢性高眼压模型具有操作简单，重复性好，成模率高，高眼压可稳定维持较长时间等优点，是较为理想的大鼠慢性高眼压模型。

　　2．在慢性高眼压情况下，视网膜三种胶质细胞（星型胶质细胞、Müller细胞、小胶质细胞）均存在活化现象；活化的星型胶质细胞、小胶质细胞还伴有明显细胞形态结构的变化。

　　3．小胶质细胞可能是视网膜最早发生病理改变的部位。

　　4．在慢性高眼压情况中，活化的视网膜胶质细胞（包括星型胶质细胞、Müller细胞以及小胶质细胞）TNF-α的表达明显增加。

　　5．在慢性高眼压情况中，视网膜内层胶质细胞TNFR-1表达增加，表明胶质细胞既是TNF-α的主要生产者，也是其作用的重要靶细胞之一。

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