作者：许军，赵江月，王洪学，孙林，徐艳春，张劲松
作者单位：1（110005）中国辽宁省沈阳市，中国医科大学附属第四医院眼科；2（134300）中国吉林省白山市八道江区医院眼科；3（110001）中国辽宁省沈阳市，中国医科大学基础医学院化学教研室；4（110001）中国辽宁省沈阳市，中国医科大学附属第一医院眼科
【摘要】 目的：雏鸡形觉剥夺性近视眼及形觉剥夺性近视恢复眼中视网膜、脉络膜和巩膜中视黄酸含量的作用。
方法：选用新孵出的普通肉食家鸡75只，采用半透明薄膜眼罩遮盖的方法对左眼进行形觉剥夺，分为形觉剥夺组，遮盖时间为14d；形觉剥夺恢复组,遮盖11d后，去遮盖3d。两组的右眼作为对照眼。暗室内处死小鸡后，立即摘出眼球。冰台上用角膜钻取直径为8mm的后极部眼组织块，手术显微镜下快速分离出视网膜、脉络膜及巩膜纤维层和软骨层组织。将每3个标本作为一个样品。取空白样品，加入全反视黄酸标准溶液，按样品处理方法操作后，绘制标准曲线，根据标准品的色谱分析，分别确定出各组织中视黄酸的出峰位置，根据计算机的色谱工作站计算出样品的含量。
结果：正常眼视网膜、脉络膜、巩膜中均有RA存在,其中脉络膜中RA含量最高,其次为巩膜及视网膜，其中巩膜纤维层的含量高于软骨层中的含量(P <0.05)。形觉剥夺14d后, 视黄酸含量在视网膜中明显增高(P <0.01，n =10)；在脉络膜中明显下降(P <0.01)；在巩膜软骨层及纤维层中RA均明显下降(P <0.01) ，其中,纤维层中下降得更为明显。除去形觉剥夺3d后，视黄酸含量在视网膜中明显下降 (P <0.01)；在脉络膜中明显升高(P <0.01)，为剥夺眼视黄酸水平的7倍；在巩膜软骨层和纤维层中明显升高(P <0.01),且纤维层中的含量高于软骨层中的含量(P <0.05) 。
结论：形觉剥夺及去形觉剥夺时，小鸡视网膜、脉络膜、巩膜纤维层及软骨层中视黄酸含量均发生了明显的变化，后极部巩膜纤维层中视黄酸含量变化比软骨层更为明显。
【关键词】 全反视黄酸；幼鸡；形觉剥夺；近视；巩膜；视网膜；脉络膜；高效液相色谱
Change of all-trans retinoic acid content in the retina, choroid and sclera of the chick with different visual environment
Jun Xu1, Jiang-Yue Zhao1, Hong-Xue Wang2, Lin Sun3, Yan-Chun Xu4, Jin-Song Zhang1
1Department of Ophthalmology, the Fourth Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110005, Liaoning Province, China; 2Department of Ophthalmology, Badaojiang District Hospital of Baishan City, Baishan 134300, Jilin Province, China; 3Department of Chemistry, China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China; 4Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China
Abstract AIM: To study the role of the all-trans retinoic acid (RA) level of retina, choroid and sclera in chicken form-deprivation myopic eyes and form-deprivation myopic recovery eyes. METHODS: Seventy-five newly incubated carnivorous chicken were selected. Their left eyes were covered with semitransparent membrane to deprive form perception, and were divided into 2 trial groups: form-deprived group: covering for 14 days, and recovery group: covering for 11 days followed by uncovering for 3 days. Unoccluded eye in either group served as control eyes respectively. Eyeballs were extracted immediately after the chickens were executed at the dark room. Posterior ocular tissue of 8mm in diameter was taken by cornea drill on dry ice table. Retina, choroid and sclera fiber layer and cartilage layer were isolated rapidly under microscope. Every 3 specimen were treated as one sample. Standard solution of all-trans retinoic acid was added into blank sample and after sample processing procedures, standard curves were protracted. The peak position of retinoic acid in all tissues was found according to chromatography analysis of control standard substance. Finally the levels of retinoic acid in samples were calculated by computer chromatography workstation. RESULTS: In normal eyes, RA existed in retina, choroids and sclera, with choroids the most followed by sclera and retina, with fibrous layer contained more than cartilage layer (P<0.05). After 14 days of form-deprivation, RA in retina increased significantly (P <0.01, n =10), while decreased significantly in choroids, sclera cartilage layer and fibrous layer (P<0.01), among which scleral cartilage layer deceased the most. After 3 days recovery from form-deprivation, RA in retina decreased significantly (P <0.01), while increased significantly in choroids, which was 7 times greater than form-deprivation eyes. RA level in sclera cartilage layer and fibrous layer elevated significantly (P <0.01), with scleral fibrous layer contained more than cartilage layer (P <0.05) CONCLUSION: During form-deprivation and form-deprivation recovery, retinoic acid levels in retina, choroid, scleral fibrous layer and cartilage layer change significantly, and retinoic acid level in posterior scleral fibrous layer changes more than cartilage layer.
· KEYWORDS: all-trans retinoic acid; chicken; form deprivation; myopia; sclera; retina; choroids; high performance liquid chromatography
0引言
近视是一种发育性疾病[1]，眼轴的发育是由视觉控制的，实验性近视眼球生长的始发因素及其后的控制因素均位于视网膜的特定部位[2]。视网膜自身能够识别外界物体是否成像在其平面上[3]，继而释放一种未知的信使分子控制其下方组织的生长速率[4]。在视网膜细胞内合成的全反视黄酸 （all-trans retinoic acid , RA）可能就是调节实验性近视眼球生长的一个信使分子,又称维生素A酸，是维生素A最具活性的代谢产物，在脊椎动物眼球发育中具有不同的重要作用。研究表明，RA是一种内源性的反应分子，在视网膜细胞内可以合成，不仅与视网膜的视觉生理有关，能调节视网膜的光反应，同时也是细胞分化和生长的一个潜在的调节因子。其作为体内的一种非甾体类激素，可以直接与核受体相结合来参与不同目标基因的转录[5-7]，诱导一些生长因子和它们的受体表达，进而诱导特异环境下的细胞分化过程[8]。所有这些使其具备了作为信使的条件，因此近年来引起了人们的极大关注。我们以雏鸡为实验对象，采用高效液相色谱分析的方法来测定形觉剥夺与去剥夺不同视环境下视网膜、脉络膜和巩膜中视黄酸的含量，探讨视黄酸在形觉剥夺性近视中的作用。
1材料和方法
1.1材料 选用新孵出的普通肉食家鸡75只，体质量30～45g，沈阳市于洪区华联鸡雏场提供，雌雄兼用。Waters(美国):510泵、2 487紫外检测器、Millennium 32工作站、U6K进样器，离心机 80-2型（上海手术器械厂），恒温水浴震荡器 SHZ-88（苏州太仓市试验设备厂），超声波细胞破碎机（德国dr’hhielscher UP2000H），电子称DP211D（德国），手术显微镜（日本），BHT（butyl hydroxytoluene, 2,6-二叔丁基对甲苯酚）（Sigma），全反式视黄酸（Sigma）。
1.2方法 选用新孵出的普通家鸡75只，孵出后2d，将左眼进行形觉剥夺,火棉胶将半透明薄膜制成的眼罩固定到鸡眼眶周围的羽毛上。固定后，剥夺眼可以自由地睁闭；右眼用火棉胶将中间无薄膜的眼罩固定在其眼眶周围的羽毛上，作为对照眼。其中30只雏鸡眼的剥夺时间为14d，作为形觉剥夺组，另30只剥夺时间为11d，之后去剥夺，允许该剥夺眼有3d恢复的时间，作为形觉剥夺恢复组。另取15只雏鸡（共30眼）作为空白对照组。采用室内饲养，白天用自然光照射，维持12h/12h的黑／昼周期。暗室内，红光下，过量氯仿处死小鸡后，立即摘出眼球。无菌操作，冰台上锯齿缘处对半切开眼球，将前段眼组织和玻璃体除去，用角膜钻取直径为8mm的后极部眼组织块（位于后极部巩膜梳的鼻侧，且与巩膜梳相切），置于冰冷的PBS液中，手术显微镜下快速分离出视网膜、脉络膜及巩膜组织，然后进一步在显微镜下，用手术刀片将巩膜纤维层和软骨层分离开。将上述组织快速置入灭菌的Eppendorf管中，外包金属铝铂纸，标号后快速放入液氮中保存，冷冻后移入－70℃冰箱中储存待用。色谱柱Inertsil ODS-3(5μm,250mm×4.6mm)（GL.Sciences Inc.Japan）；保护柱Scitnhome Scientific, Inc. C18(5μm)； 流动相：甲醇:120g/L醋酸铵缓冲液＝90∶10；流速：0.8mL/min；紫外检测波长：350nm；柱温：室温。暗室内，红光下，用精密电子秤先称Eppendorf管质量，然后取冷冻的组织标本，每3个标本作为一个样品，置入上述已称过的Eppendorf管内，再称出管加样品的质量，然后减去管的质量，即得样品的湿重。称重后样品，加入10mg/L BHT10μL后，加PB＋NaCl(10mmolPB,pH7.2，30mmol/L NaCl)溶液0.5mL，匀浆后，加0.05mol/L KOH +乙醇液0.5mL，用乙醚2mL提取去除上层脂类，下层相同NH4Cl 500mL酸化，用乙醚2mL提取2次，每次加入乙醚后旋涡振荡提取0.5min,2 000r/min，离心5min，合并乙醚提取液至尖底试管中，在40℃水浴中用N2吹开，残渣加流动相溶液100μL溶解，取20μL进样。另取空白样品，分别加入全反视黄酸标准溶液10，20，40，100μg/L后，按样品处理方法操作后，以RA浓度为横坐标，以反应峰高值为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数。根据标准品的色谱分析，确定RA的峰形及出峰时间，参照标准品的峰形及出峰时间确定所测样品的出峰位置，选择好峰基线后，由其软件分析系统可得出峰高值，根据计算机的色谱工作站（数据采集，处理和分析的计算机软件），计算出样品的含量，作为最终所需的含量值。
统计学处理：SPSS10.0统计软件包（Ver10.0），采用t检验方法对各组进行比较。
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