作者：卢春光，胡 丹，惠延年
【摘要】 观察腺病毒介导人脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor, BDNF）基因在培养的雪旺细胞（Schwann cell, SC）中的表达，为视神经损伤修复提供可靠的组织工程用的种子细胞。
方法：在293细胞中培养扩增BDNF重组腺病毒（adenovirally delivered BDNF, Ad-BDNF），采用蚀斑形成试验测定其感染滴度。体外培养SD大鼠源性的SC，以Ad-BDNF感染培养的SC，用逆转录—聚合酶链反应（reverse transcriptase polymerse chain reaction, RT-PCR）检测BDNF mRNA的表达，用免疫印迹技术（immunoblot assay, Western Blotting）和酶联免疫反应检测（enzyma-linked immumosorbent assay, ELISA）培养液上清中BDNF的表达。
结果：Ad-BDNF经扩增后可获得较高感染滴度的重组腺病毒载体。在正常培养条件下未经Ad-BDNF感染的SC低表达BDNF，而感染3d后的SC其BDNF表达明显升高，表达量随时间延长而增加，并能在感染21d后仍维持高表达趋势。
结论：Ad-BDNF可以介导BDNF基因转染到培养的SC中，后者可以在较长时间内高效表达BDNF。
【关键词】 视神经损伤
0引言
视神经作为特殊分化的中枢神经，其损伤后局部微环境中的神经营养因子（neurotrophic factor, NTF）在其修复和再生的过程中发挥了重要作用，脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor, BDNF）就是较早被肯定的其中之一[1]。在体内和离体实验中已证实，BDNF可维持、促进外周神经嵴和外胚层基板来源的多种感觉神经元的发育、生长和分化[2]，支持视网膜神经节细胞（retinal ganglial cell, RGC）的体外存活[3]，在治疗神经系统疾病和视神经损伤中有重要意义。雪旺细胞（Schwann cell, SC）的BDNF基础分泌量很有限[4]，采用基因转染技术可使SC具有高效分泌BDNF的能力，再将其通过组织工程学的方法移植到视神经损伤部位，既能维持BDNF的有效作用浓度达到促进视神经修复和再生的目的，又能避免BDNF给药途径上的不便。目前，采用腺病毒载体介导实现BDNF基因在体外培养的SC中表达的研究尚未见报道。我们采用载有人BDNF基因的重组腺病毒（Ad-BDNF）感染SD大鼠源性SC，从mRNA和蛋白分子表达水平检测BDNF基因在SC中的表达情况并探讨其进一步意义。
1材料和方法
1.1材料 所用Ad-BDNF系与中国军事医学科学院基础医学研究所合作研制，本实验室保存，293细胞系本实验室保存。山羊抗S-100多克隆抗体、兔抗BDNF多克隆抗体（Sata Cruz公司），Trizol总RNA提取液和RT-PCR反应试剂盒（Invitrogen公司），BDNF蛋白ELISA检测试剂盒（Promega公司），新生SD乳鼠购自第四军医大学实验动物中心。
1.2方法
1.2.1 Ad-BDNF的扩增及滴度测定 正常培养的293细胞密度达到90%汇合时，加入适量Ad-BDNF液，更换为含50mL/L新生牛血清的DMEM培养液继续培养3~5d，收集出现细胞病变效应（cytopathic effect, CPE）的293细胞，在-80℃和37℃之间反复冻融3次，离心弃沉淀，病毒上清再经CsCl线性密度梯度超速离心纯化后收集分装于-80℃保存备用。Ad-BDNF的感染滴度采用蚀斑形成试验测定。
1.2.2 SD大鼠源性SC的培养 将7日龄SD乳鼠脱颈处死后，剪取双侧坐骨神经用含青霉素、链霉素（均为500kU/L）的PBS溶液浸洗、去除血污。神经组织加入2.5g/L胰蛋白酶、2g/LⅠ型胶原酶混合消化60min后终止，100目筛网过滤，收集滤液， 1 000r/min离心5min，沉淀加入含100mL/L胎牛血清的DMEM培养液重新悬浮，采用双30min差速黏附法接种细胞，置于37℃，50mL/L CO2条件下培养。接种24h后向培养液中加入10-5mol/L/阿糖胞苷抑制成纤维细胞生长，24h后吸弃，更新培养液继续培养，以后3d更换1次培养液，至细胞融合后以2.5g/L胰蛋白酶消化传代。采用山羊抗S-100多克隆抗体免疫细胞化学进行鉴定。选用第3～4代的细胞用于实验。
1.2.3 Ad-BDNF感染 SC 取密度为5×108/L的SC悬液2mL接种到6孔板孔内，当细胞密度大于80%时，吸弃培养液，根据不同MOI计算所需的病毒量，取相应体积的Ad-BDNF液加入孔内，37℃，50mL/L CO2条件下感染SC，90min后吸弃，更换为正常培养液继续培养。
1.2.4 RT-PCR检测BDNF mRNA的表达 以MOI分别为0（即未感染对照组）, 50, 100, 200, 400的病毒量感染SC，感染后24h将各组SC收集于塑料离心管中，10 000r/min离心10min，加入Trizol液0.1mL使细胞充分裂解后加入氯仿0.02mL抽提，12 000r/min离心15min，吸取上清加入异丙醇0.05mL，室温放置10min后12 000r/min离心10min，沉淀加入750mL/L乙醇清洗混匀后，7 500r/min离心5min，沉淀37℃烘干后溶于DEPC水20μL中，用A 260 /A 280比值鉴定RNA纯度。在Invitrogen公司的ThermoScriptTM RT逆转录酶作用下，以Oligo(dT)20为引物，50℃反应1h，85℃反应30min，将RNA逆转录合成cDNA。取逆转录反应液2μL进行PCR扩增，BDNF cDNA特异性引物序列参照文献设计[5]，上游引物为5’-CACTCTGACCCTGCCCGCCGAG-3’，下游引物为5’-GCATTTAGGTGACACTATAG-3’，产物长度为430bp。反应条件：94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环。取10μL扩增产物行10g/L琼脂糖凝胶电泳检测，条带的光密度由凝胶成像仪分析。
1.2.5 Western Blotting检测培养液上清中BDNF蛋白的表达 以MOI分别为0，50，100，200，400的病毒量感染SC，感染后24h收集培养液上清。上清经低速离心去除分子质量小于3 000u的蛋白，150g/L SDS-PAGE电泳后，蛋白经100V恒压，1h电转移至硝酸纤维素膜上，TBST洗膜后用30g/L BSA/PBS室温封闭2h，兔抗BDNF多克隆抗体（1∶100）4℃孵育过夜，TBST洗膜后用HRP标记的羊抗兔IgG（1∶100）室温孵育3h，TBST洗膜后ECL化学发光法显影，条带的光密度由凝胶成像仪分析。
1.2.6 ELISA检测BDNF蛋白表达的时效性 感染组以MOI为200的病毒量感染的SC，对照组为正常培养的同一代SC，分别在感染后3，6，9，12， 15，18，21d收集培养液上清。收集到的上清保存于-80℃。检测步骤按照Promega公司的BDNF蛋白ELISA检测试剂盒说明书进行。全部数据采用SPSS12.0统计软件进行方差分析。
2结果
2.1 Ad-BDNF的滴度测定 Ad-BDNF的感染滴度经蚀斑形成试验测定，病毒原液扩增、纯化后的感染滴度为8.16×1012pfu/L。
2.2培养SC形态鉴定 在倒置相差显微镜下可见，SD大鼠源性原代SC接种24h后多数细胞已贴壁、伸展；72h后生长良好，形成较多单克隆集落。原代SC经8～10d传代1次。SC的典型形态为长梭状，胞体细长，胞核不明显，胞膜折光性强；细胞间呈复层生长，胞体相互重叠，单克隆集落常呈索带状。S-100染色阳性细胞为SC，其胞体内出现棕黄色着色（以胞质为主,强阳性时胞核也会出现着色），细胞边界清楚，与镜下所见形态一致。
2.3感染后SC中BDNF mRNA的表达 提取感染各组和对照组SC的总RNA，用RT-PCR均扩增出了约430bp的基因片段，与构建的表达单元大小一致，其中cDNA条带灰度以MOI为200组为著，对照组最低。此结果证实，经Ad-BDNF感染的SC有BDNF mRNA的转录表达，且表达量明显高于未感染的SC；MOI为200感染时，人源性BDNF基因转染效率最高（图1）。
0:未感染对照组，1:MOI＝50，2:MOI＝100，3:MOI＝200，4: MOI＝400，M:DNA Marker
图1 不同MOI感染SC后BDNF mRNA的表达
2.4感染后SC无血清培养液上清中BDNF的表达 由于构建的BDNF基因带有BHGpA信号肽序列，因此SC表达的蛋白可以分泌至培养液上清中。经Western Blotting检测， Ad-BDNF感染各组和对照组的SC培养液上清均有13ku的BDNF蛋白条带存在，其中蛋白条带灰度以MOI为200组为著，对照组最低。此结果证实，经Ad-BDNF感染的SC的BDNF表达量明显高于正常培养的SC；MOI为200感染时表达效率最高，这与RT-PCR检测的mRNA结果比较吻合（图2）。
0:未感染对照组，1:MOI＝50，2:MOI＝100，3:MOI＝200，4: MOI＝400
图2 不同MOI感染SC后培养液上清中BDNF的表达
2.5 ELISA检测培养液上清中BDNF的表达 感染的SC在感染3d后BDNF表达量即开始出现升高，6～12d升高趋势明显，15~21d升高趋势减缓，但BDNF表达量能够维持在较高水平，即15, 18, 21d时BDNF表达量无显著性差异(多样本均数间SNK-q检验，P＞0.01)。对照组也表现出随着时间变化，BDNF表达量升高趋势，但在各时间点BDNF表达量均明显低于感染组(配对t检验，P＜0.01，表1)。
3讨论
在研究视神经损伤的早期，学者们普遍认为视神经作为特殊分化的中枢神经在损伤后不可修复和再生，这一观点直到1981年才被Aguayo等[6]推翻，他们发现受损的RGC轴突在含有SC的周围神经桥接物中可以再生。其中SC不仅在视神经损伤处形成细胞索支持和引导再生的神经轴突长入和延伸，还能分泌包括BDNF在内的多种NTF营养受损的RGC[7]。之后的研究又证实BDNF对于视神经损伤修复是较为肯定的。Sawai等[8]采用眼球内注射BDNF可以促进轴突切断后RGC的存活及轴突的再生。Hisanari等[9]将负载有细胞外基质（extracellular matrix, ECM）、体外培养的SC和BDNF的硅胶导管桥接大鼠视神经断端，结果发现其对RGC轴突再生的促进作用明显优于负载任一单因素的硅胶导管。侯旭等[10,11]采用向视神经夹伤后的大鼠玻璃体腔内注射Ad-BDNF的方法发现，其可以转染外源性BDNF基因到RGC中并促进RGC的存活及轴突的再生。但这些方法在临床应用上仍缺乏可行性和安全性，作用比较有限。
我们借助组织工程学和基因转染技术将培养的SC和外源性BDNF基因结合起来，试图将其进一步应用于视神经损伤修复。在转染效率和表达效率的平衡点上我们选择了腺病毒载体，它不仅能够感染包括神经元细胞和胶质细胞在内的多种细胞[12]，而且具有转染效率高，耐受性好，低病源性等优点。结果证实，Ad-BDNF可以有效感染体外培养的SD大鼠源性SC，并介导外源性BDNF基因转染到SC中，而转染有BDNF基因的SC可以高效表达BDNF蛋白。通过以不同MOI感染SC，我们发现制备后感染滴度为8.16×1012pfu/L的Ad-BDNF在MOI为200时转染BDNF基因效率最高。这可能与制备的Ad-BDNF本身性质有关。
在探讨感染的SC分泌BDNF的时效性时，我们发现随着感染后时间的延长，分泌的BDNF在短期内（感染后3d）即呈现出明显的升高趋势，说明腺病毒载体转染的高效性。在10d内（感染后3～12d）很快达到较高浓度后进入维持阶段，维持10d（感染后12～21d）甚至更长时间。这种长效性为将其应用于视神经损伤修复，避免多次反复给药提供了先决条件。与未感染对照组比较，感染组在各个时间点的表达量均明显高于对照组（P＜0.01），分别在感染后12，15，18，21d升高了5.2，5.0，4.7，4.4倍。在维持阶段，感染组的BDNF表达量略有下降，可能与SC生长密度过高、发生接触抑制和少数外源性BDNF基因的衰减、丢失等因素有关。
总之，通过腺病毒介导外源性BDNF基因的转染，可以获得高效、长效表达BDNF蛋白的SC，这将为进一步修复视神经损伤和恢复一定程度的视功能提供前提条件。在含有高浓度BDNF的微环境下，受损的RGC可能更容易存活、轴突更容易再生。转染有BDNF基因的SC能否通过细胞支架材料复合移植的方法应用于视神经损伤后RGC的修复和再生？这些问题还有待下一步实验解决。
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