作者：曾洁萍 段俊国
作者单位：610075 四川成都，成都中医药大学眼科实验室
【摘要】 观察灯盏花提取成分（DSX）对持续性高眼压大鼠眼压及视网膜基因表达的影响。方法 （1）将SD大鼠分为3组，空白组不造模，模型组和治疗组用Akira法造模。（2）测定三组大鼠在术后即刻、术后第1天、术后每7天的眼压，至术后1个月。（3）处死大鼠，提取视网膜的totalRNA，制作成芯片并分析。结果 （1）术前3天大鼠的平均眼压为（13.44±1.50）mm Hg，术后即刻眼压平均升高147%，术后1个月，模型组平均眼压是术前的1.99倍，实验组眼压与空白组基本相同。（2）与空白组比较，模型组有1个与细胞凋亡相关的基因NGFR表达上调，与模型组比较，实验组的NGFR表达下调。CRYGD、CRYBB3、CRYBB2表达上调。结论 DSX对持续性高眼压大鼠视网膜有保护作用。
【关键词】 视网膜 持续性高眼压 基因表达 凋亡 灯盏花
Retina gene expression of rat model with chronic,moderately elevated intraocular pressure by DSX
ZENG Jie-ping，DUAN Jun-guo.Eye Laboratory of Chengdu TCM University,Chengdu 610075，China
［Abstract］ Objective To observe the intraocular pressure and the gene expression of retina of the rat model of chronic,moderately elevated intraocular pressure （IOP） by DSX drawed from Herba Erigerontis.Methods （1）By the method of Akira，the rat model of chronic,moderately elevated intraocular pressure was got.（2） We monitored the intraocular pressure continuously for 3 day and made Oligo gene array.Results （1）The average IOP was （13.44±1.50）mm Hg before operation and it elevated 147% after operation.One month later,The average IOP of model group was 1.99 times than preoperation.The average IOP of test group was as same as preoperation.Conclusion DSX could protect the retina of the rat model of chronic,moderately elevated intraocular pressure.
［Key words］ retina；chronic,moderately elevated intraocular pressure；gene expression；apoptosis;Herba Erigerontis
青光眼（glaucoma）是指与眼压升高有关的以视网膜神经纤维萎缩、视盘凹陷和视野缺损为主要特征的一组疾病，为临床常见的继白内障之后的第二位致盲性眼病。灯盏花提取成分（DSX）是从中药灯盏花中提取的有效成分。目前已证明灯盏花具有活血化瘀、通窍明目的作用，能保护高眼压状态下的RGCs免受或少受损伤并挽救凋亡细胞［1］，在此基础上，我们进行了进一步的研究，现总结资料如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物 8～12周龄SD大鼠，体重约150～200 g。均符合一级动物标准。饲料为全价鼠颗粒饲料。SD大鼠及饲料均由成都中医药大学实验动物中心提供（生产合格证：川实动管质第99-11号）。饲养室温10 ℃～15 ℃，相对湿度55%～75%，12 h光照维持，自由摄食饮水。纳入标准：（1）无外眼部疾病。（2）双眼瞳孔直接对光反射和间接对光反射正常。
1.2 主要试剂 戊巴比妥钠（上海化学试剂厂分装）、1%地卡因（成都中医药大学附属医院制剂室）、0.25%氯霉素眼液（长春迪瑞制药有限公司）、RNAlater（QIAGEN公司）、EDTA-Na2（国药集团化学试剂有限公司）NucleoSpin RNA clean-up试剂盒（MACHEREY-NAGEL,Germany）等。DSX由中药灯盏花提取制成。
1.3 主要仪器 电子秤（上海天平仪器厂）、电子天平（上海天平仪器厂）、眼科显微手术器械（苏州医疗器械厂）、眼科手术显微镜（苏州医疗器械设备厂）、TONO-PEN笔式眼压计（美国Medtronic solan 公司）、眼科手术止血器（大连山木医疗器械厂）、大鼠Oligo芯片、LuxScan10KA双通道激光扫描仪（CapitalBio公司）等。
1.4 方法
1.4.1 动物分组 动物购回后，适应性驯养3天，每天连续测量眼压，剔除平均眼压高于或低于正常眼压区间的大鼠，其余随机分为空白组、模型组和实验组3个组。空白组不造模，模型组和实验组右眼单眼造模。模型组于术后第4天开始每日用生理盐水3 ml灌胃1次，实验组用DSX 3 ml，所有大鼠均于1个月后处死。
1.4.2 造模方法 采用Akira法［2］，烙闭SD大鼠右眼3支上巩膜静脉。
1.4.3 眼压测量及芯片制作 （1）眼压测量：实验中所有眼压测量均在同一时间（ 9 am ～ 2 pm）进行，连续测量的术前眼压的平均值作为正常眼压；术后即刻、术后1天、术后每7天各测1次眼压，共1个月。（2）芯片制作：大鼠脱颈处死，立即摘除眼球，从角巩膜缘切开眼球，剥离视网膜，提取totalRNA，再经纯化、荧光标记、杂交等过程制作成Oligo芯片，用LuxScan 10KA双通道激光扫描仪进行扫描。
1.4.4 统计学方法 采用SPSS 14.0 for Windows统计软件。自身左右眼及前后比较用配对t检验，多组间两两比较用单因素方差分析（LSD法）。差异基因的挑选采用t-test。
2 结果
2.1 动物造模结果 SD大鼠40只，经连续测量3天眼压，剔除眼压不合格的大鼠1只，其余39只随机分出空白组9只，其余SD大鼠进行造模。造模时麻醉死亡4只，从造模后第2天开始，连续测量3天眼压，在造模后第4天，将剩余26只平均分为模型组和实验组。按预定方案在造模后第2天实验组开始灌胃。在1个月的饲养过程中，空白组于第15天时自然死亡1只。模型组于第20天自然死亡1只，实验组于第10天死亡1只，死亡原因为灌胃窒息死亡。术后术眼有轻、中度球结膜充血水肿，无感染，给予金霉素眼膏、0.25%氯霉素眼液，2～3天后眼部充血水肿消失。至处死前，空白组有SD大鼠8只，模型组12只，实验组12只。
2.2 眼压测量结果 术前3天39只大鼠78眼的平均眼压为（13.44±1.50）mm Hg，术后即刻模型组26眼眼压平均升高147%，术后1个月即处死前一天模型组平均眼压是术前的1.99倍，实验组平均眼压与空白组基本相同。造模前后眼压平均值曲线，见图1，造模前后眼压差、模型眼不同时间点眼压及双眼眼压比较，见表1。由表1可见：（1）造模前各组大鼠眼压经统计学处理，差异均无统计学意义（P>0.1）；（2）造模后用药前，模型组及实验组眼压与空白组比较，差异有统计学意义（P<0.01）；（3）用药后1个月，模型组及实验组眼压与造模前、造模后用药前及空白组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。 表1 各组大鼠组间及造模、用药前后眼压比较 注：与模型组比较，*P＜0.01；与空白组及造模前比较，ΔP＜0.01；与用药后1个月比较，▲P＜0.01
2.3 持续性高眼压对大鼠视网膜基因表达的影响 见表2。表2表明：与空白组比较，模型组有1个与凋亡基因（NGFR）表达上调，与模型组比较，实验组的凋亡基因NGFR表达下调。具有视网膜保护作用基因晶状体蛋白（CRYGD）、晶状体蛋白BB3（CRYBB3）、晶状体蛋白BB2（CRYBB2）表达上调。表2 DSX对持续性高眼压大鼠视网膜基因表达的影响
3 结论
DSX能使NGFR表达下调，CRYGD、CRYBB3、CRYBB2表达上调，具有视网膜保护作用。
4 讨论
NGFR作为一种经典的神经营养因子，在轴突的生长和细胞的存活方面起着非常重要的作用，并能促进损伤后神经元再生。神经系统损伤后，NGF效应神经元表达NGFR增加，而且靶区NGF的水平也明显升高。实验证明P75NTR可选择性地导致细胞程序性死亡，在神经系统中扮演凋亡使者的角色，而此作用能够因其结合了NGF而被抑制［3］。
Fisher等［4］发现晶状体内物质能显著促进RGCs的存活和轴突再生，其原因与晶状体含内源性保护物质（可溶性晶状体蛋白）有关。这种晶状体蛋白被证实有α、β、γ3种亚型，α晶状体蛋白具有分子伴侣活性，其亚单位αA、αB 属于小分子热休克蛋白家族成员，能抑制细胞凋亡，在保护视网膜色素上皮细胞、光感受器细胞以及晶状体上皮细胞的损伤过程中发挥重要作用［5］。王晓芹等［6］利用原代培养RGCs进行的相关研究发现:α晶体蛋白能够促进RGCs生长，细胞膜上抗体结合阳性，表明α晶体蛋白可与RGCs膜结合，这在α晶体蛋白促进RGCs存活和轴突再生的反应中可能起重要作用。潘凌等［7］利用视神经损伤和晶状体损伤模型研究发现，晶状体损伤具有强大的促进RGCs的存活和促进视神经再生的作用。本次研究中，实验组与模型组比较：CRYGD、CRYBB3、CRYBB2表达上调，这一实验结果与目前已经发现的晶体蛋白具有促进RGCs的存活和轴突再生的作用一致。但是本次发现的晶状体蛋白多为β型，与以往的报道在蛋白的分型不同，但目前对β型晶状体蛋白的研究很少，需要更多的研究才能对此现象进行分析。
灯盏花的主要功效是活血化瘀、通经活络,对脑血管及心血管有通痹解结之效。现代药理学研究表明,其主要成分灯盏花素具有扩张脑血管、降低脑血管阻力、增加脑血流量、改善微循环、抑制血管增生、抗血小板聚集等作用。临床应用广泛，在眼科主要用于治疗后天性麻痹性斜视、皮质盲、急性缺血性视神经病变［8］以及视网膜震荡伤［9］、糖尿病视网膜病变［10］。对大鼠实验性高眼压的研究也表明灯盏细辛注射液具有改善大鼠实验性高眼压后视神经轴浆运输的作用［11］。大量的实验证实灯盏花具有抗细胞凋亡作用［12］。本实验利用持续性高眼压大鼠的视网膜，探讨DSX的细胞保护作用，发现DSX的作用途径可能是使神经营养因子受体NGFR表达下调，从而起到抑制视网膜细胞凋亡，保护RGCs的作用，同时晶状体蛋白表达上调，也能起到抑制细胞凋亡的作用。
【参考文献】
1 路雪婧.DSX对持续性高眼压大鼠模型视网膜神经节细胞损害的干预及机理研究.成都中医药大学博士学位论文，2003.
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3 Shahrooz R,Justin OH,Zhong LT,et al.Induction of apoptosis by the low-affinity NGF receptor.Science,1993,261:345.
4 Fisher D,Heiduschka P,Thanos S.Lens-injury-stimulated axonal regeneration throughout the optic pathway of adult rats.Exp Neurol,2001,172（2）:257-272.
5 Maddala R,Rao VP.Alpha-crystallin localizes to the leading edges ofmigrating lens ep ithelial cells.Exp Cell Res,2005,306（1）:203-215.
6 王晓芹,王一.α晶体蛋白对视网膜神经节细胞作用的初步研究.第三军医大学学报,2006,28（19）:1955-1958.
7 潘凌,郑华,万瑾，等.晶状体损伤促进视神经再生的作用及机制.解剖学杂志,2006,29（1）:7～10.
8 谢丹红.灯盏花素的临床应用进展.新医学,2007,38（6）:408-410.
9 刘涛,陆艳,王作先.灯盏花素注射液治疗视网膜震荡伤临床观察.现代中西医结合杂志,2007,16（4）:450-451 |
