作者：王丽娜 作者单位：大连医科大学附属第一医院 眼科，辽宁 大连 116011；
【摘要】 目的 通过对比分析正常中国人眼前极和后极部内层巩膜组织细胞外基质中Ⅰ型胶原蛋白的分布特点，探讨其分布的差异对人巩膜组织抗拉伸力的影响，为寻求病理性近视的发病机制提供客观依据。方法 应用非穿透小梁切除术获取15例自愿捐献角膜的健康正常人眼的前、后极部巩膜组织（不伴有病理性近视），用Western blot的方法检测各组巩膜组织的Ⅰ型胶原蛋白，并测定各样本β-actin和Ⅰ型胶原蛋白电泳条带灰度值，以β-actin电泳条带为参照，求出各样本Ⅰ型胶原蛋白电泳条带灰度值和β-actin电泳条带灰度值比值。结果 在100 kD处可见Ⅰ型胶原的蛋白条带，正常人眼后极部Ⅰ型胶原蛋白的表达水平明显低于前极部，差异有显著统计学意义(P<0.01)。结论 正常人眼前极部和后极部Ⅰ型胶原纤维蛋白的分布存在差异，后极部明显低于前极部。
【关键词】 巩膜组织 病理性近视 Ⅰ型胶原蛋白 Western blot
病理性近视(pathological myopia，PM)的发展与巩膜胶原积聚减少、巩膜变薄、巩膜组织减少有 关[1]。在高度近视的眼中，巩膜胶原纤维直径也缩减，其发生与巩膜的明显变薄有关。眼球强韧的外壳促进眼球大小的改变，巩膜变薄主要在后极部，巩膜变得更易扩张，抗拉伸力减弱。胶原占巩膜净重的90%[2]，其中绝大部分为Ⅰ型胶原，其对维持眼球的基本形态，阻止巩膜组织的扩张，增加抗拉伸力有着重要的作用。本实验以Ⅰ型胶原纤维（collagen type Ⅰ）为研究目标，应用Western blot方法，检测正常中国人眼巩膜组织中Ⅰ型胶原蛋白的表达水平，探讨其分布的差异对人巩膜组织抗拉伸力的影响，为寻求病理性近视的发病机制提供客观依据，探讨其在病理性近视发生、发展中的可能作用。
1 对象和方法
1．1 对象 2005~2007年大连医科大学附属第一医院眼科搜集的健康成年人15只眼的前、后极部内层巩膜组织（实质层+棕黑板层），来源于肾脏移植中心自愿捐献的角膜。各组兼顾年龄、地区及种族差异[3-4]，均为男性，年龄为18～35岁。东北地区汉族人。眼球摘除后尽快用A型超声测量仪测眼轴，长为23.96～24.50 mm。无家族遗传病史及自身免疫病史[5-6]。巩膜前极和后极的分界为赤道部。
前极部组：15例15眼，取自自愿捐献角膜的健康成年人前极部近角巩膜缘2 mm处的内层巩膜组织，大小为6 mm2，厚度约为0.3 mm。
后极部组：15例15眼，取自自愿捐献角膜的健康成年人后极部内层巩膜组织，距视神经乳头颞侧边缘3 mm，大小为6 mm2，厚度约为0.4 mm。
1．2 实验方法 在供眼上按照标准抗青光眼非穿透小梁切除术制作板层巩膜瓣，切除标准大小的新鲜内层巩膜组织，同时切除后极部同样大小的内层巩膜组织，置Ep管中，蜡膜封口，液氮快速冷冻后于-80℃冰箱保存。各组取材均为同一术者。
1．3 实验步骤 首先组织蛋白提取：加入蛋白裂解液于4℃过夜，以同样的方法在4℃提取2~4 h，将蛋白样品置于4℃下，15000 r/min，离心5 min，取上清液，于-80℃冻存待测蛋白质浓度（台式高速低温离心机：AllegraTM 64R Centolfuee BECKMAN COULTER，USA），然后进行Western blot印迹杂交反应。Western bolt印迹杂交参照文献方法[7]进行。
①采用紫外分光光度仪（50 CONC：Cary 50 VARIAN，Austria）测定灌注组的蛋白样品浓度（兔抗人collagen type Ⅰ多克隆抗体：SANTA CRUZ 公司；蛋白Marker：中国大连TaKaRa生物工程有限公司）。②予10% SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离。③转膜。④collagen type Ⅰ抗体标记及显色。⑤β-actin抗体标记及显色。⑥凝胶成像系统分析各组collagen typeⅠ蛋白电泳条带及其β-actin电泳条带平均灰度（UVP-CA91786凝胶成像分析系统，美国GENE公司）。
1．4 统计学方法 采用SPSS12.0统计软件进行配对设计的两样本均数t检验（Paired-Sample t Test）。
2 结果
2．1 Western blot印迹杂交电泳条带结果 见图1。图1中A、B组为正常眼前、后极两组的看家基因。从C组和D组中可见，正常人眼后极组条带灰度明显低于前极组。
2．2 Ⅰ型胶原蛋白的表达情况 通过分析各组的巩膜组织中Ⅰ型胶原蛋白的表达水平可见，在正常人眼后极组，其胶原蛋白含量明显低于前极组，差异有统计学意义（t=9.128，P<0.01），见表1。
3 讨论
巩膜组织主要由细胞外基质和极少的细胞成分组成，胶原是细胞外基质的重要组成成分，它占巩膜净重的90%，到目前为止共发现了21个胶原亚 型[8]。已证实，Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅷ和Ⅻ型胶原蛋白在人和哺乳动物巩膜组织中表达，并且被证实表达于哺乳动物巩膜上的Ⅶ、IX、XV、XVI和XVII胶原亚型，很可能也表达于人的巩膜上，其中Ⅰ型胶原占巩膜总胶原量的绝大部分。巩膜的组织结构由内向外共分三层[9]，巩膜上层、实质层和棕黑板层。巩膜上层胶原纤维较细，排列方向不规则。巩膜实质层由致密的胶原纤维束组成，胶原纤维束是由平行排列的胶原纤维组成，胶原纤维束表面相互平行，内面向各个方向发出分支又相互融合，形成纤维之间的交错。巩膜棕黑板层由更细小的胶原纤维束组成。
Ⅰ型胶原是细胞外基质的重要组成部分，在体内分布广泛，在皮肤、骨骼、肝脏、眼等器官细胞外基质中普遍存在。在巩膜细胞外基质中，Ⅰ型胶原蛋白占绝大部分，其基本结构单位为三股螺旋，由两个a1（Ⅰ）和一个a2（Ⅰ）组成长300 nm、直径1.5 nm的蛋白质，即原胶原[10]，分子中至少有一个结构域具有α链组成的三股螺旋构象（即胶原域），其三螺旋结构间无二硫键，具有四级结构，是很稳定的、韧性很强的胶原纤维，分子量约2400 kD的一种纤维性蛋白，形成巩膜组织中的大量纤维束，虽然其韧性很大，但是缺乏弹性，作为组织支持物，其在维持眼球的基本形态、阻止眼轴延长方面发挥着重要的作 用[11]。此外，其胶原微纤维还可以和Ⅳ型胶原蛋白及蛋白多糖分子相结合[12]，使巩膜组织结构更加稳固。故其表达量的改变必然导致巩膜组织细胞外基质生化特性发生改变，巩膜组织稳固性下降，眼轴不断延长，以及病理性近视的进行性发展[13]。
本实验研究结果提示，正常人眼巩膜组织前极部与后极部Ⅰ型胶原蛋白分布存在着显著差异，巩膜组织后极部Ⅰ型胶原蛋白表达水平显著低于前极部（P<0.01）。因Ⅰ型胶原蛋白具有很强的韧性和抗扩张的能力，所以其对维持眼球的基本形态，增加巩膜组织抗拉伸力有重要的影响。正常人眼巩膜组织前、后极部Ⅰ型胶原蛋白分布的差异，必然使后极部巩膜较前节眼球抗扩张的能力产生减弱的影响，因此，在病理性近视发生、发展过程中，巩膜组织的降解、变薄、丢失主要发生在后极部，并且扩张、变薄的后极部巩膜产生局部弹性改变或葡萄肿。同时也进一步表明，病理性近视的发生、发展与巩膜组织Ⅰ型胶原蛋白表达改变有明显的相关性，其表达量的改变很可能是病理性近视的致病因素之一。
综上所述，正常中国人眼巩膜组织的后极部Ⅰ型胶原蛋白表达量比前极部明显降低，并且这种差异很可能影响后极部巩膜组织抗拉伸和扩张的能力，而且也成为高度近视巩膜组织的改变容易发生在后极部的依据之一。
为进一步探索防治病理性近视的有效途径，本课题组正在通过做以下几方面的研究进一步探讨巩膜胶原蛋白与病理性近视的相关性：①研究病理性近视人眼巩膜组织中Ⅰ型胶原蛋白表达的差异性。②通过对人Ⅰ型胶原蛋白编码基因的基因结构及单核苷酸多态性的研究进而进一步探讨其与病理性近视的相关性。③研究及确定其他在人眼巩膜组织 中表达的胶原蛋白的功能及其与病理性近视的相 关性。
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