【摘要】 目的：观察热休克蛋白8（heat shock protein 8，HSP8）基因在幼年和成年Longevans大鼠视皮层中的表达水平，探讨其在视觉可塑性关键期中的作用。方法：采用半定量RTPCR方法，分析处于视觉可塑性关键期内的幼年Longevans大鼠和处于视觉可塑性关键期后的成年Longevans大鼠视皮层中HSP8基因的表达水平。结果：幼年大鼠和成年大鼠视皮层间HSP8 mRNA表达量有显著性差异，成年大鼠视皮层中HSP8/G3PDH为0.68±0.03，幼年大鼠视皮层中HSP8/G3PDH为0.14±0.06，HSP8 mRNA在成年大鼠视皮层中表达水平显著高于幼年大鼠（P<0.05）。结论：HSP8基因在视觉可塑性关键期后的成年大鼠视皮层中呈高水平表达，是视觉可塑性关键期终止相关的候选基因。
【关键词】 热休克蛋白8基因； 视皮层；可塑性；大鼠
WenShan Jiang, ZhengQin Yin
Foundation item:National Science Fund for Distinguished Young Scholars of China (No. 30025014)
Southwest Ophthalmology Hospital, the Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
Correspondence to:ZhengQin Yin. Southwest Ophthalmology
Hospital, the Third Military Medical University, Chongqing 400038, China. [email protected]
Abstract AIM: To observe heat shock protein 8 (HSP8) gene expression level in visual cortex of juvenile and adult Longevans rats and to investigate the role of HSP8gene in the critical period of neuroplasticity in visual cortex.METHODS: The expression levels of HSP8gene were analyzed through semiquantitative RTPCR in the visual cortex of juvenile and adult Longevans rats. Juvenile rats were in the critical period of visual plasticity whereas adult rats had passed this period.RESULTS: The expression levels of HSP8 mRNA were significantly different between the visual cortex of juvenile and adult rats. In adult rats HSP8/G3PDH was 0.68±0.03, whereas in juvenile rats it was 0.14±0.06. The expression level was significantly higher in the visual cortex of adult rats than that of juvenile rats (P<0.05).CONCLUSION: HSP8gene was highly expressed in the visual cortex of adult rats which had passed the critical period of visual plasticity. The results confirmed that HSP8gene was the candidate gene related to the termination of the critical period of visual plasticity in the rat.
KEYWORDS: heat shock protein 8 gene; visual cortex; plasticity; rat
引言
人类和哺乳动物出生时视觉系统尚未发育成熟，出生后在发育的一定时期内视觉系统具有相当大的可塑性，能够根据环境刺激调整和改变与生具有的神经联系和突触结构。这个时期称为视觉可塑性关键期［1,2］。动物成长至视觉可塑性关键期以后，视皮质神经元突触的可塑性就会降低直至消失，因此临床上对弱视的治疗也就存在一个时间限制。对处于视觉可塑性关键期的儿童弱视，临床治疗效果理想，而对于处于视觉可塑性关键期后的大龄弱视患者，治疗的效果非常有限。国内外学者围绕着视觉可塑性机制进行了很多研究，但目前的研究多集中在对视觉可塑性相关基因及蛋白进行研究［35］，对决定视觉可塑性关键期终止的分子机制的研究却鲜见报道。我们在前期实验中应用抑制性消减杂交技术在大鼠视皮层中筛选出一批与视觉可塑性关键期终止相关的基因，首次发现（heat shock protein 8，HSP8）基因参与了视觉可塑性关键期的终止［6,7］。对HSP8基因在大鼠视皮层中的表达情况，既往未见文献报道。我们应用半定量反转录聚合酶链式反应(semiquantitative reverse transcriptionpolymerase chain reaction， SqRTPCR)技术，分析处于视觉可塑性关键期内的幼年大鼠和处于视觉可塑性关键期后的成年大鼠视皮层中HSP8基因的表达水平，从而探讨HSP8基因在视觉可塑性关键期终止中发挥的作用。
1材料和方法
1.1材料
大鼠视觉发育可塑性关键期开始于睁眼时，于出生后28d处于高峰期，出生后32d左右视觉可塑性关键期终止 ［8］。依据大鼠视觉可塑性关键期的时间段，选择出生后28d的幼年大鼠作为视觉可塑性关键期动物模型，而以出生后60d的成年大鼠作为视觉可塑性关键期终止动物模型。实验采用同等条件下饲养的Longevans大鼠，根据出生后的天龄分为幼年组 (28d组)3只，成年组（60d组）3只。总RNA提取采用Tripure Isolation Reagent(Roche公司)，RTPCR反应采用Takara RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0 (TaKaRa公司)，Marker Ⅱ(北京天为时代科技有限公司)。根据Genebank中HSP8，G3PDH基因的序列，以Primer Premier 5.0软件设计引物序列，由Takara公司代为合成。HSP8基因引物：Sense primer 5 GACTTCTACACCTCCATTACCCG 3，Antisense primer 5 GTGACATCCAAGAGCAGCAAA 3，产物大小为317bp。内参G3PDH基因引物：(Sense primer) 5TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3，(Antisense primer) 5ACCACAGTCCATGCCATCAC3，产物大小为423bp。
1.2方法
幼年组、成年组Longevans大鼠各3只（购自第三军医大学大坪医院野战外科研究所动物实验中心），乙醚麻醉后断头处死，迅速取出大脑，依据大鼠脑立体定位图谱［9］,开颅后无菌分离出视皮层(枕叶后端0～3mm范围，包括17区及部分18区大脑皮质)，投入液氮速冻。用Tripure Isolation Reagent对视皮层总RNA进行提取。对提取的总RNA行甲醛变性凝胶电泳以检验其完整性，同时以紫外分光光度计测量RNA纯度。根据A260值计算所提取的总RNA的浓度，分别将各样本总RNA以无RNAse水稀释至终浓度为2g/L，确保每个样本以等量的RNA为模板进行RTPCR。将RNA样本置于70℃低温保存备用。各样本分别在不同的PCR管中建立反转录反应体系：MgCl2 2μL，10×RT buffer 1μL，RNase free dH2O 3.75μL，dNTP mixture(各10mol/L) 1μL，RNase inhibitor 0.25μL，AMV reverse transcriptase 0.5μL，Oligo dTadaptor primer 0.5μL，各样本总RNA (2g/L) 1μL。按以下条件进行反转录反应：50℃逆转录30min，然后99℃5min灭活AMV逆转录酶，5℃ 5min。按下列组成统一配制PCR反应混合液(Master Mix)：5×PCR buffer 100μL，dH2O 277.5μL，TaKaRa Ex Taq HS 2.5μL。在反转录反应结束后的各个PCR反应管中分别加入统一配制PCR反应混合液38μL、HSP8基因的上、下游引物(10mol/L) 各0.5μL及内参G3PDH基因的上、下游引物(10mol/L)各0.5μL。按以下条件进行PCR反应：94℃ 2min, 94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1.5min, 30次循环，72℃10min。反应完成后分别取8μL PCR反应液 ，在15g/L琼脂糖凝胶上样电泳。电泳完毕后用凝胶成像分析系统成像，采用Labworks软件对各组RTPCR产物的电泳条带进行吸光度分析，并以HSP8的相对表达量即HSP8/G3PDH的A值之比为指标进行统计学分析。
统计学处理：应用SPSS10.0统计分析软件包，两组间比较采用t 检验。
2结果
2.1大鼠视皮层总RNA的质量及纯度鉴定
紫外分光光度计测量总RNA的质量和纯度，A260/A280的比值均大于1.8，证明所提取的RNA纯度符合要求。甲醛变性凝胶电泳结果(图1)：各样本总RNA电泳均可见清晰的28S及18S带，28S带的亮度是18S带亮度的1.5～2倍。表明所提取的总RNA质量好，无明显降解。
2.2 半定量RTPCR结果
幼年组、成年组大鼠各样本RTPCR产物经电泳检测，证实分别在317bp和423bp处呈现特异性扩增条带(图2)，所有样本中均有HSP8基因及G3PDH基因表达。根据PCR反应中所使用的引物，判定其中317bp处条带对应为HSP8基因扩增产物，而423bp处条带对应为G3PDH基因扩增产物。采用Labworks软件对各组RTPCR产物的电泳条带进行光密度分析并以HSP8的相对表达量即HSP8 /G3PDH的A值之比为指标进行统计学分析(表1)。采用SPSS软件行t检验：成年大鼠视皮层中HSP8/G3PDH为0.68±0.03，幼年大鼠视皮层中HSP8/G3PDH为0.14±0.06，t=15.226，P<0.05，表明两组间HSP8 mRNA表达量有显著性差异，HSP8 mRNA在成年组大鼠视皮层中表达水平显著高于幼年组。表1 大鼠视皮层HSP8 mRNA表达 Labworks软件分析结果(略)
3讨论
对基因表达水平的测定，传统的方法主要有斑点杂交、Northern blotting等几种方法。但是由于mRNA含量少，且在转膜等操作过程中极易降解，故增加了实验的难度。近年来发展了一种简捷、特异的含内标化的RTPCR半定量检测mRNA的方法，也称半定量反转录聚合酶链式反应 (SqRTPCR)。该方法是以逆转录和多聚酶链反应技术为基础的一种快速、灵敏、特异的体外扩增DNA的分子生物学技术。该方法使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样本分析成为可能。是目前探讨基因转录表达水平的有效手段，与传统的Northern blot法比较，半定量RTPCR具有灵敏度高、所需样本量少、无同位素污染和快速等优点。尽管该方法不能像实时定量RTPCR和竞争性RTPCR一样能对mRNA进行真正准确定量，但由于其操作简便、耗费较低，因而在临床及定量研究上仍不失为一种较好的方法，故该方法在不同研究领域也得到广泛应用［1012］。在实验的具体操作中，mRNA 的提取程序复杂又极易降解，可能会对定量结果产生一定的影响 ，故在实验中要严防RNase污染。RNase主要由坏死的细胞释放，广泛存在于生物介质和环境中。RNA提取过程中防止RNA内源性降解与外源性RNase污染是保持RNA完整性的关键。我们在实验操作过程中严格执行操作规程，经反复摸索，提取到了高质量的RNA用于后续实验，并将各样本RNA稀释成相同浓度，采用等量的RNA样本用于实验，保证了结果的可靠性。
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