【摘要】 探讨干扰RNA（siRNA）沉默缺氧培养下人的视网膜色素上皮细胞（hRPE）中整合素连接激酶（ILK）的表达及其对缺氧诱导因子1α（HIF1α）表达的影响。
方法：CoCl2建立hRPE细胞的化学缺氧模型，Western blot和RTPCR方法半定量检测不同缺氧时间（0，6，12，24，48h）hRPE细胞中ILK、HIF1α蛋白及其mRNA的表达；阳离子脂质体转染ILK的干扰片段抑制缺氧24h hRPE细胞中ILK的表达，同上方法检测转染后缺氧24h hRPE细胞中ILK的表达及其对HIF1α表达的影响。
结果：ILK表达于正常及缺氧培养的hRPE细胞中。随着hRPE细胞缺氧时间的延长，在蛋白和mRNA水平ILK、HIF1α都呈现逐渐增加的表达趋势。siRNA抑制ILK在缺氧24h hRPE细胞中的表达，同时显著抑制了HIF1α的表达，较阴性对照组、单纯脂质体组有显著差异（P<0.01）。
结论：ILK可以通过HIF途径应答RPE细胞的缺氧反应。
【关键词】 缺氧 RNA干扰
0引言
缺氧是缺血缺氧性视网膜脉络膜病变发生的关键。视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial, RPE)细胞在其病理过程中起着不可忽视的作用。整合素连接激酶(integrim linked kinase, ILK)是一种新发现的丝氨酸/苏氨酸激酶，能够参与整合素、生长因子、WNT等信号传导通路，与细胞的持续增殖、粘附性丧失、迁移以及血管的生成都有密切的联系，新的研究发现ILK也可作为低氧应激有关众多胞内分子的上游应答者，在内皮细胞中应答缺氧。我们通过CoCl2建立hRPE细胞的化学缺氧模型来探讨缺氧培养hRPE细胞中ILK的表达及对缺氧诱导因子HIF1α表达的影响。
1材料和方法
1.1材料
DMEM/F12细胞培养基，OptiMEMI无血清培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；Trizol，逆转录试剂盒，TAG酶均购自北京中杉公司，蛋白提取试剂盒购自赛百胜公司。PCR引物由上海基康生物公司合成，lipofectamine2000，siRNA干扰片段由广州瑞博公司设计合成。
DAB试剂盒、兔抗ILK多克隆抗体，鼠抗HIF1α的mAb(美国Santa Cruz公司)。角膜移植的供体眼，于死亡后12h之内进行分离培养，以5×107/L细胞密度接种6孔培养板中培养，逐步扩增至常规培养传代。抗人角蛋白抗体免疫细胞化学染色进行细胞鉴定，获得纯度高达100%的RPE细胞（图1）[1,2]。
1.2方法
hRPE取3～6代细胞用于实验，用含150μmol/L CoCl2的培养基模拟化学缺氧培养。转染前将用于实验的hRPE细胞共分为5组：分别为含150μmol/L CoCl2的培养基继续培养6，12，24，48h，另设一个不含CoCl2的100mL/L FBS常规条件培养的对照组，即缺氧0h组；hRPE细胞再分为阴性对照、阳性对照、单纯脂质体、ILKsiRNA干扰组转染后继续缺氧培养24h。
1.2.1 Western blot免疫印记
根据上述分组收集细胞，提取细胞总蛋白,Bradford法测定样本蛋白质浓度,制胶（12％、5％的分离胶，）,在积存胶加样孔内加入等量蛋白质样本和标志物电泳转膜，TBST (5%脱脂奶粉!10mmol/L Tris!100mmol/L NaCl，0.1%Tween20,pH7.5)37°封闭1h后再与1∶500的一抗(兔抗ILK、鼠抗HIF1α抗体) 4℃孵育过夜，次日再用TBST洗膜,加入辣根过氧化物酶偶联的二抗IgG (1∶800稀释),室温摇动2h,再用TBST洗膜,最后按照说明要求加入ECL试剂,室温下曝光。照相,分析蛋白条带积分吸光度(A)值，重复时完全一致。
1.2.2 RTPCR半定量检测目的基因的表达
收集如上分组培养细胞，按Trizol操作说明.分别提取总RNA紫外分光光度计定量，调整RNA质量浓度，内参选用人的βactin。RNA样品经逆转录反应合成cDNA第一链，然后进行PCR扩增。ILK引物序列5’GGCTCAGGATTTTCTCGCA 3’ 5’CTGCTGAGCGTCTGTTTGTG3’，399bp；HIF1ɑ5’CCCAGATTCAGGATCAGACAC3’，5’TTGGGATATAGGGAGCTAACATC3’ ，228bp内参照βactin：5’TGGATGATGATATCGCCGC3’5’GTAGATGGGCACAGTGTGGGT3’，501bp。25μL反应体系进行PCR扩增，产物经15g/L琼脂糖凝胶电泳(含0.5g/L溴化乙腚)，拍照，使用GelPro Analyzer 4.0分析软件测量目的基因及内参βactin的积分吸光度(A)值，并分别计算每条带与内参的比值，即相对积分吸光度值(relative integral absorbance, RIA)，作为目的基因的相对表达量。表1 hRPE细胞转染后缺氧24hILK及HIF1α的蛋白（灰度值±s）及mRNA表达（略）
1.2.3细胞基因转染
根据GenBank数据库提供的人的:ILK全长基因(GenBank No.)的靶序列mRNA：（5’3’）TGGACACCGTGATATTGTA；设计合成siRNA干扰序列：正义链（5’3’）uggacaccgugauauugua dTdT，反义链（3’5’）dTdT accuguggcacuauaaca u。胰酶消化处于对数生长期的细胞，用无抗生素DMEM/F12新鲜生长培养基稀释细胞后传代六孔板，在无抗生素的培养基中培养24h后，细胞融合率达60％时开始转染。操作按lipofectamine2000试剂说明进行，分别用OptiMEMI培养基稀释siRNA和转染试剂。以50nmol/L浓度进行转染。转染后6h换成含150μmol/L CoCl2的培养基继续缺氧培养24h，阴性对照以FAM荧光标记、阳性对照加入βactin干扰片段、单纯脂质体组不加入siRNA，其他与转染组处理相同。
统计学处理：计量资料以(±s）表示,差异显著性采用方差分析及独立样本的t检验,统计运算采用SPSS11.5 for Windows统计软件进行处理,以P<0.05作为差异有显著意义。
2结果
2.1转染前
ILK在正常细胞培养条件下蛋白表达为609.76±34.08，缺氧6h后明显升高至793.13±21.67，持续高表达至缺氧48h；正常培养条件下hRPE细胞中未检测到HIF1α的蛋白表达，缺氧6h表达显著的升高至817.76±34.08，并持续高表达至缺氧24h，缺氧6，12，24，48h各组细胞中ILK,HIF1α表达与正常对照组有显著差异，P<0.01；RTPCR显示在正常培养条件下hRPE细胞存在ILK,HIF1α的转录，随着缺氧时间延长两者呈现了相同的转录增加趋势。ILKsiRNA可成功转染hRPE细胞，荧光显微镜下观察转染率大于80％（图2），符合实验要求。阳性对照βactin被显著抑制，表明转染体系正常，以siRNA转染hRPE细胞后缺氧24h，ILK及HIF1α的表达结果见表1。ILKsiRNA转染显著抑制了ILK的表达，抑制了HIF1α的蛋白及mRNA的表达。转染组ILK及HIF1α的蛋白及mRNA的表达较无关转染组及单纯脂质体组P﹤0.01，均有显著差异。无关对照组与脂质体组无显著差异P>0.05。
3讨论
对蛋白质的Ser/ Thr或Tyr的转译后修饰是细胞生命活动的核心调控机制。而细胞内蛋白质的磷酸化水平是由蛋白激酶和蛋白磷酸酶的活性协同控制的。胞内激酶的一个重要作用是参加信号传导，通过信号传导细胞能够对来自外界的信息做出功能性的回应。整合素连接激酶( integrim linked kinase, ILK)是一个Ser/ Thr蛋白激酶。它能介导细胞与胞外基质的相互作用并通过下游底物蛋白激酶B和糖原合成酶激酶3将胞外信号向下游传递，其在血管生成、细胞凋亡、细胞迁移方面都发挥着重要的作用，可在部分上皮细胞中呈现高表达。视网膜新生血管( retinal neovascularization,RNV)及脉络膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)疾病的发生和进展中，视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial, RPE)在其病理过程中起着关键的作用。HIF1是细胞对氧浓度改变的一系列自适应反应中重要的调节因子，是缺氧诱导基因转录的关键环节，也是缺氧诱导基因转录过程中缺氧信息传递的共同通路?HIF1是由120kDa的亚基和91～94kDa的β亚基构成异二聚体，HIF1α是HIF 1的调节及活性亚基，可被缺氧诱导表达[3,4]。
本实验Western blot显示人的视网膜色素上皮存在ILK的基础表达，随着缺氧时间的延长表达升高，同时伴随着HIF1α的表达上调，RTPCR显示其转录水平也是同步上调，为了验证在hRPE细胞中是否存在ILK的活化上调HIF1α的表达，从而应答缺氧，导致血管新生。运用小分子RNA干扰（siRNA）通过瞬时转染使缺氧培养条件下的人RPE细胞的ILK基因表达被沉默，结果导致了一个显著的HIF1α的下调，表现在蛋白及转录水平。证实在视网膜色素上皮中ILK为HIF1α上游的一个调控点。Tan等[5]也为检验ILK的抑制效果用高表达ILK的活性和快速组成VEGF的PC3 and DU145前列腺癌细胞，通过瞬时表达负性ILK，或是给与小分子的ILK的抑制剂，VEGF和它的主要的转录活性因子HIF1α均应答了ilk的抑制，这与本实验结果一致。因为ILK是PI3K 依赖性的，而下游靶点是PKB/Akt，它是可能通过调节PKB活化而提高HIF lα的稳定性表达。另外，因为HIF1α转录调节是通过mTOR/ FRAP,来调节的，它是Akt的一个下游靶基因，ILK通过调节Akt活性进而调节mTOR/ FRAP,来调节HIF1α的转录水平[6]。研究发现，ILK是PKB活化的一个必要的上游调节子，运用双链RNA干扰(siRNA)和条件性基因敲除技术沉默ILK基因后，几乎可完全阻断PKB的Ser 473磷酸化, PKB活性显著受阻，从而可判定ILK作为一个低氧幸存信号的参与者[7,8]。在体外神经胶质瘤细胞的侵袭能力及新生血管形成的研究中同样发现ILK是基本的，对于HIF的表达和作为结果产物的VEGF的表达存在着上游调控的作用，通过QLT0267使ILK的功能失活结果导致跟着akt和mTOR/FRAP的磷酸化的降低，HIF的蛋白表达水平下降。在许多类型的肿瘤细胞凋亡及侵袭的研究中均发现抑制ILK的活性会抑制PKB/Akt serine473 的磷酸化及其活性，但是在正常的非致瘤性的成纤维细胞中不出现其调节PKB/Akt的磷酸化和活性的效应。由此可见，视网膜色素细胞中ILK在缺氧条件下对刺激HIF1α的表达扮演着关键的角色，通过阻断ILK的活性或是阻断ILK的信号途径可以为缺血、缺氧性视网膜脉络膜病变提供新的治疗思路。
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