1.2.4  细胞mRNA的提取及逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）  剪切力作用结束后，以37℃预热的无菌磷酸盐缓冲液轻柔洗一次，然后收集细胞备用。收集的细胞用Trizol提取总RNA，反转录合成cDNA第1链，对产物进行PCR。退火温度分别为c-fos：54℃，1 min；c-myc：54℃，1 min；GAPDH：55℃，1 min。GAPDH反应为30个循环，c-fos和c-myc反应为35个循环。PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳，于紫外灯下观察照相。采用Kodak Digital Science 1D分析软件分别读取各片段灰度值，以c-fos的灰度值与GAPDH灰度值的比值代表c-fos mRNA的水平，以c-myc的灰度值与GAPDH灰度值的比值代表c-myc mRNA的水平。实验重复3次，取各时间点的平均表达水平作为其最终水平。

    1.3  统计学方法  采用SPSS13.0统计分析软件，对RPE细胞受剪切力作用后不同时间点间c-fos和c-myc mRNA的比较进行单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。绘图采用Origin 7.0软件。

    2  结果

    2.1  细胞形态的变化  未暴露于剪切力作用下的RPE细胞呈多角形或不规则形，生长达融合状态后表现为接触抑制。2 dyne/cm2剪切力作用0.75 h后，细胞间隙开始加大，部分细胞形状变圆、变小；当剪切力作用1.5 h后，细胞的极性改变为与剪切力的作用方向一致。

    2.2  剪切力对RPE细胞c-fos mRNA表达的影响

    在未受剪切力作用的RPE细胞中，c-fos mRNA表达水平低；随着剪切力作用时间的增加，c-fos mRNA的表达逐渐增强，并于1.5 h时达峰值，随后开始减低（见图1）。与剪切力未作用组相比，剪切力作用在0.25 h、0.5 h、0.75 h、1 h、1.5 h和3 h这六个时间点上RPE细胞c-fos mRNA的表达差异均有统计学意义（P<0.01，见表1）。

    2.3  剪切力对RPE细胞c-myc mRNA表达的影响

    在未受剪切力作用的RPE细胞中，c-myc mRNA表达水平低；在剪切力作用时间≤1 h时，c-myc mRNA水平无显著改变；当剪切力作用1.5 h时，c-myc mRNA的表达明显增强，随后略有减弱（见图2）。与剪切力未作用组相比，剪切力作用1.5 h和3 h这两个时间点RPE细胞c-myc mRNA的表达差异均有统计学意义（P<0.05，见表1）。

    3  讨论

    眼球处于不断的运动中，其中有多种运动力的产生及传递。剪切力产生于眼球的运动过程中，并可能在玻璃体后脱离、视网膜裂孔和视网膜脱离的发生、发展中起重要作用[5-6]。

    我们分析，剪切力对RPE的作用大概有4个方面：①眼球受到外力后，机械力在眼内传递，其会通过玻璃体而对视网膜产生牵拉和剪切作用。②随着年龄的增长及近视度数的增加，玻璃体逐渐发生液化。在眼球的运动过程中和运动后，自由运动的玻璃体会对视网膜产生牵拉力和切力，这些力量会传递给RPE。③视网膜裂孔形成后，一些血浆成分及玻璃体进入视网膜下，RPE细胞处在视网膜下液这样一个流动的环境中，液体及其产生的机械力对RPE细胞可产生多方面的效应，剪切力便是其中重要的一个作用。④持续的玻璃体的机械牵拉可刺激视网膜细胞的增生从而引起视网膜前膜的形成，而前膜收缩可对其下的RPE造成切线的作用力[2，7]。这些剪切力可能在视网膜和RPE细胞的生物学表现中起关键的作用[2，6]。

    研究表明，剪切力可改变细胞的形态[8]，且可在早期、短时间内快速上调血管内皮细胞c-fos、c-jun、c-myc和早期生长反应因子1等转录因子的表达[9]，这对于细胞生物学结构和功能的改变有着重要的作用。

    c-fos和c-myc均是即刻早期基因家族的重要成员。c-fos的表达产物fos可以形成同源二聚体，也可以与c-fos的表达产物形成异二聚体，它可增强启动子区含有结构的基因转录（如胶原蛋白、肌动蛋白等），与细胞的生长、分化、增殖关系密切[10]。在培养的细胞中，c-fos高表达可使细胞周期从G1期进入S期。c-myc是细胞凋亡的调控相关基因之一，其蛋白产物c-myc在细胞质中合成，与其他蛋白质进行寡聚化后，再移到细胞核内与细胞DNA核心序列结合，从而激活或抑制多种靶基因的转录，从而促进细胞增殖或诱导细胞凋亡[11]。

    我们研究发现，在2 dyne/cm2剪切力的作用下，RPE细胞c-fos和c-myc mRNA的表达均在短时间内快速增强至峰值，随后开始减弱。这说明此种强度的剪切力可快速上调RPE细胞c-fos和c-myc的表达，且其上调作用只发生在剪切力作用的早期，或者说RPE细胞对剪切力作用的应答期十分短暂。这可能是其被称之为即刻早期基因的原因所在，有人认为这是因为许多信号表达的半衰期都很短。虽然c-myc和c-fos mRNA均在1.5 h时达峰值，但与c-myc相比，c-fos对剪切力的反应更迅捷，在极早期表达即开始增强，且增长幅度更高。从我们的实验中可观察到，剪切力作用1.5 h时，c-myc mRNA和c-fos mRNA的表达均增强至峰值，且同时，RPE细胞的极性改变为与剪切力的作用方向一致。c-myc和c-fos mRNA的表达峰值出现在同一时间点，说明此时RPE细胞中这两种转录因子的活性最强，两者对剪切力的反应速度相近。但细胞极性改变与这两种转录因子活性之间是否有关联，还需要更进一步的实验来证实。

    我们的研究表明，剪切力可改变RPE细胞的形态和极性，且c-fos和c-myc参与剪切力对RPE细胞的早期作用。但不同强度的剪切力对RPE细胞c-fos和c-myc表达的不同影响，c-fos和c-myc在剪切力对RPE细胞作用过程中的具体途径和机制等问题，还需要进一步的研究来加以阐明。

    【参考文献】

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    [3] Wakefield D， Lloyd A. The role of cytokines in the pathogenesis of inflammatory eye disease[J]. Cytokine，1992，4(1)：1-5.

    [4] Theilmeier G， Lenaerts T， Remacle C， et al. Circulating activated platelets assist THP-1 monocytoid/endothelial cell interaction under shear stress[J]. Blood，1999，94(8)：2725-2734.

    [5] Repetto R， Stocchino A， Cafferata C. Experimental investigation of vitreous humour motion within a human eye model[J]. Phys Med Biol，2005，50(19)：4729-4743.

    [6] Repetto R， Stocchino A， Cafferata C. Experimental investigation of vitreous humour motion within a human eye model[J]. Phys Med Biol，2005，50(19)：4729-4743.

    [7] 王静波，惠延年. 剪切力对视网膜色素上皮细胞syndecan-1，血管细胞黏附分子-1，E-选择素蛋白表达和肌动蛋白的影响[J]. 国际眼科杂志，2006，6(6)：1021-1024.

    [8] Duan Y， Gotoh N， Yan Q， et al. Shear-induced reorganization of renal proximal tubule cell actin cytoskeleton and apical junctional complexes[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(32)：11418-11423.

    [9] Hsieh HJ， Li NQ， Frangos JA. Pulsatile and steady flow induces c-fos expression in human endothelial cells[J]. J Cell Physiol，1993，154(1)：143-151.

    [10] Cheng TH， Shih NI， Chen CH， et al. Role of mitogen-activated protein kinase pathway in reactive oxygen species-medicated endothelin-1-induced beta-myosin heavy chain gene expression and cardiomyocyte hypertrophy[J]. J Biomed Sci JT， 2005，12(1)：123-133.

    [11] Wang Y， Toury R， Hauchecorne M， et al. Express and subcellular localization of the Myc superfamily proteins： c-myc， Max， Mad 1 and Mxi 1 in the epiphyseal plate cartilage chondrocyte of growing rat[J]. Cell Mol Biol，1997，43(2)：175-188.

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