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3讨论
3.1 VEGF及其受体的研究 血管生成抑制因子及促进因子两者之间的平衡影响着内皮细胞的活动状态，影响着血管的生长。打破这一平衡，上调促进因素就带来新生血管的生长。众多实验证实VEGF（血管内皮生长因子）在新生血管形成中起至关重要的作用[35]。VEGF通过作用于细胞上高亲和力的受体发挥其生物学作用。VEGF的受体包括VEGFR1（Flt1）和VEGFR2(KDR)等，其中VEGFR2在内皮细胞增殖过程起主要作用[68]。也是本实验选择的研究对象。凝血酶对血管内皮细胞有损伤作用，并促进VEGF的分泌，能增加血管内皮细胞对VEGF有丝分裂作用的敏感性，对内皮细胞增殖效应有协同作用，这种协同作用是剂量时间依赖和受体介导的，并且具有特异性[9,10]。前期实验证明，凝血酶促进体外培养的RF6A细胞的增殖以20NIHU/mL的浓度作用最佳。1h即开始，8～12h达最高。本实验选择8h作为观察点。
表1各组细胞爬片平均光密度值、灰度值分析结果 （略）
经SPSS 13.0统计软件包采用单因素方差分析表明：各组A值F=78.852,Sig＝0.000，P<0.01，n=5。各组间差异有统计学意义。各组灰度值F=559.618,Sig＝0.000，P<0.01，n=5。各组间差异有统计学意义
3.2水蛭提取物的药理作用 中药水蛭是破血逐瘀代表药，广泛用于活血化瘀的组方中。近年的许多研究发现水蛭及其唾液中含有多种活性成份，包括水蛭素，组织胺样物质，蛋白质，抗血栓素等。水蛭素有拮抗凝血酶强抗凝作用，也可抑制凝血酶对内皮细胞刺激诱导血管生成的作用，是凝血酶的特异性抑制剂。水蛭各提取物也有类似作用[1113]。VEGF与新生血管的密切关系使不少研究者尝试减少VEGF的产生或阻断VEGF与其受体的结合从而防治新生血管性疾病。我们将水蛭引入VEGF受体的研究，探寻活血化瘀治法的机制。
3.3水蛭提取液使RF6A细胞VEGFR2表达减少，抑制细胞增殖的机制探讨 诱导新生血管发生的信号主要经VEGFR2 转导, 经多种信号通路, 最终引起细胞分裂、增生和移行等效应。当VEGF与VEGFR2相结合时，致VEGFR2形成二聚体，其胞内酪氨酸激酶区域相互接近，并发生磷酸化，进而导致信号蛋白的一系列磷酸化反应，最终将信号传入细胞核内，这些位点调节激酶的活性，它们的磷酸化是KDR活化必需的[14，15]。VEGF诱导KDR受体磷酸化后，向细胞内传递信号主要又有4条途径：MAPK途径，PI3K/AKT途径，Ca2＋磷脂依赖性激酶途径及NO途径[6,16,17]。实验结果显示，在凝血酶组，VEGFR2的表达较正常组下降，考虑凝血酶刺激VEGF增加，并与受体结合，完成上述信号通路传递，故在细胞表面的表达下降。在水蛭提取液组，VEGFR2的表达较空白组和凝血酶组均下降，表明水蛭提取液与VEGFR2有相互作用。在合药组，同时加入水蛭提取液及凝血酶后，VEGFR2的表达量较单加凝血酶和单加水蛭组均下降，考虑以下几种情况：(1)水蛭提取物中的抗凝血物质与VEGF竞争性的与细胞表面的VEGFR2直接发生反应，可能使受体的自体磷酸化位点发生改变，受体失活，阻断了信号向下游的传递；(2)有研究发现PKC 抑制剂能阻断VEGF 刺激引起的MAPK磷酸化,血管生成及肿瘤生长。证实VEGFR2部分是通过PKCMAPK旁路促进内皮细胞增殖的，其中PKC α和PKC ζ的活化在VEGF 诱导EC 分裂的信号转导中起着重要的作用[17]。而活化PKC 需二脂酰甘油(DAG) 和Ca2＋的共同作用。以往曾观察到VEGF 与受体结合后最早出现的生物学效应是细胞质中钙离子的增加。随后Hoffmann 等[18]用慢钙通道抑制剂羧基氨基咪唑抑制了VEGF诱导的CNV 形成, 证实Ca2＋ 的确参与了VEGF 的信号转导。前期实验也证实水蛭提取液能使RPE细胞内游离Ca2＋浓度下降[19]因此水蛭的作用点也可能在降低细胞内的游离 Ca2＋动员，影响PKC的活化，从而阻碍VEGF信号的传递抑制内皮细胞的分裂和增殖。结合单加水蛭组VEGFR2的表达也大量减少考虑水蛭与VEGF竞争性结合受体的可能性大。也可能是几种机制共同作用。
当然VEGF信号的转导是错综复杂的，研究难度很大，水蛭提取液对RF6A细胞VEGFR2的作用可能远远不至这些。本文为VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂的研发做些有益的提示，在未来的新生血管治疗中,水蛭提取物可能起到十分重要的作用。
【参考文献】
1李斌,唐化波.人类视网膜血管内皮细胞的培养与鉴定.眼科研究 2005;(1):2022
2 Capetandes A, Gerritsen WE.Simplified methods for consistent and selective culture of bovine retinal endothelial cells and percytes. Invest Ophthalmol Vis Sci1990;31(9):1738
3 Edelman JL, Castro MR, Wen Y. Correlation of VEGF expression by leukocytes with the growth and regression of blood vessels in the rat cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci1999;40(6):11121123
4周炼红,邢怡桥.血管内皮生长因子反义核苷酸抑制大鼠角膜新生血管的实验研究.中华眼科杂志2006;42(5):426 430
5李斌,李艳会,徐玲娟,等. VEGF映射ROP新生血管的初步研究. 国际眼科杂志2008;8(11):21872188
6 Witmer AN,Vrensen GF,Van Noorden CJ, et al. Vascular endothelial growth factors and angiogenesis in eye disease. ProgRetin Eye Res2003;22(1):129
7 Kinose F, Roscilli G, Lamartina S, et al. Inhibition of retinal and choroidal neovascularization by a novel KDR kinase inhibitor. Mol Vis2005;11:366373
8 Zhang H, Liu ZL. Expression of FLK1 in laserinduced choroidal neovascularization in mouse. Int J Ophthalmol(Guoji Yanke Zazhi)2007;7(3): 642 644
9 Merry A. Thrombin inhibitors and cardiopulmonary bypass. J Extra Corpor Technol2006;38(1):5256
10 Tsopanoglou NE, Maragoudakis ME. On the mechanism of thrombininduced angiogenesis,potentiation of vascular endothelial growth fator activity on endothelial cells by upregulation of its receptor. J Biol chem 1999;274(34):2396923976
11王敏，崔连群，张承俊,等.凝血酶诱导血管内皮细胞生长因子的水蛭素的抑制作用表达及水蛭素的抑制作用.中国新药杂志2004;13(9):227230
12 Ibbotson T, Perry CM. Danaparoid. a review of its use in thromboembolic and coagulation disorders. Drugs2002;62(15):22832314
13李艳玲,黄荣清,孙晓东.水蛭不同提取物抗凝活性的体外实验研究.中药材2004;27(2):123125
14 Kendall RL, Rutledge RZ，Mao X, et al. Vascular endothelial growth factor receptor KDR tyrosine kinase activity is increased by autophosphorylation of two activation loop tyrosine residues. J Biol Chem1999;274(10): 6453 6460
15 Tao Q, Backer MV, Backer JM, et al. Kinase insert domain receptor(KDR) extracellular immunoglobulin like domains 47 contain structural features that block receptor dimerizationand vascular endothelial growth factorinduced signaling. J Biol Chem2001;276(24):2191621923
16 Kranenburg O, Gebbink MF, Voest EE. Stimulation of angiogenesis by Ras proteins. Bio chem Biophys Acta2004;1654:2337
17 Zachary I, Gliki G. Signalling transduction mechanism smediatingbiological actions of the vascular endothelial growth factor family. Cardiovasc Res2001;49:568581
18 Hoffmann S, He S, Wiedemann P. Carboxyam idotriazo le inhibits sub step s of choroidal neovascularization on retinal pigment epithelial cells and choroidal endothelial cells in vitro. Ophthalmologe2004;101:993997
19郑燕林,陈海燕,吕帆,等.水蛭提取液对视网膜色素上皮细胞内游离钙离子的影响.中国中医眼科杂志2007;17(1):39 41
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