作者：李斌,郑海红,华开罗,胡军
作者单位：430030)中国湖北省武汉市，华中科技大学同济医学院附属同济医院眼科;（437100）中国湖北省咸宁市，咸宁学院基础医学院病理教研室;（430030）中国湖北省武汉市，湖北省中山医院消化内科
【摘要】 目的:研究含缬酪肽蛋白(valosincontaining protein, P97) 对高糖培养的人视网膜血管内皮细胞的作用。方法: 体外高糖培养人视网膜血管内皮细胞(HRCECs),转染P97的RNA干扰质粒到HRCECs，抑制P97的表达，观察血管内皮生长因子(VEGF)的mRNA水平变化，同时观察HRCECs增殖的变化。结果：RNA干扰P97组和对照组的ＶＥＧＦ/actin分别为: 0.21±0.03和0.10±0.01,两组差异有显著性（P＜0.05）, RNA干扰P97组和对照组,HRCECs在G1期细胞分别为44.05%±3.62%、25.21%±3.20%，两组比较差异有显著性(P＜0.05）。结论：当P97表达受抑制后，VEGF的表达增高，HRCECs的增殖增强，这些变化可能与DR的发生发展相关。
【关键词】 含缬酪肽蛋白；血管内皮生长因子；糖尿病视网膜病变；抵抗基因
P97 against the proliferation of human retinal vascular endothelial cells cultured with high glucose
Bin Li, HaiHong Zheng, KaiLuo Hua, Jun Hu
Foundation items: National Natural Science Foundation of China (No.30672278, 30872823); Natural Science Foundation of Hubei Province, China (No.2007ABA108)
Department of Ophthalmology, Tongji Hospital Affiliated to Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China; Pathology Staff Room, Basic Medical College, Xianning University, Xianning 437100, Hubei Province, China; Department of Gastroenterology, Sun YatSen Hospital, Wuhan 430030, Hubei Province, China
AbstractAIM: To investigate the effects of valosincontaining protein (P97) on human retinal vascular endothelial cells (HRCECs) cultured with high glucose. METHODS: We cultured HRCECs with high glucose in vitro, transfected RNA interference plasmid of P97 to HRCECs, inhibited the expression of P97, observed the level changes of vascular endothelial growth factor (VEGF), and viewed the proliferation of HRCECs.RESULTS: The VEGF actin in RNA interference group and control group was 0.21±0.03 and 0.10±0.01 with statistical significance (P<0.05). HRCECs at G1 period in RNA interference group and control group was 44.05%±3.62% and 25.21%±3.20%, respectively, there was statistically significant (P<0.05).CONCLUSION: When inhibiting the expression of P97, the expression of VEGF and the proliferation of HRCECs increase. These changes may be related with the development of DR.
KEYWORDS:valosincontaining protein;vascular endothelial growth factor; diabetic retinopathy; resistant gene
糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病最常见的并发症,也是最主要的致盲性眼病之一, 当前对DR遗传因素的研究，绝大部分集中在寻找糖尿病患者并发DR的易感因素，却忽略了研究少数患者患糖尿病很长时间却没有并发DR的原因。由于当前没有有效的药物阻止DR的发生,我们推测在那些不易并发DR的患者体内可能具有特殊的基因表达来抵抗糖尿病对视网膜血管的损伤，它们是对DR具有抵抗作用的基因，简称DR抵抗基因。我们在前期研究发现含缬酪肽蛋白(valosincontaining protein, P97)与糖尿病患者不发生DR密切相关,可能是我们所要寻找的DR抵抗基因,本文对P97的作用进行研究。
1材料和方法
1.1材料 细胞培养试剂：20g/L胰酶(Sigma公司，美国)，0.66g/L II型胶原酶(Gibco公司,美国)，胎牛血清(四季青公司，中国)，DMEM培养液(Gibco公司，美国)，纤维连接蛋白(Invitrogen公司，美国)，内皮细胞培养液(Gibco公司,美国)，胰岛素转铁蛋白硒添加物ITS(Gibco公司,美国),内皮细胞生长因子ECGF(Sigma公司,美国)，第 Ⅷ因子相关抗原抗体（DAKO公司,美国）。新鲜人眼球取自手术室角膜移植术后的废弃眼球（术前均具备由本院伦理委员会批准的患者知情同意书）。生化试剂和仪器：Hot star Taq Polymerase试剂盒(Qiagen公司,德国)，SYBR GreenⅠ荧光染料(ABI公司,美国);Trizol Reagent Kit RNA提取试剂盒（基因公司，中国香港），ABI7300 Real time PCR仪（ABI公司,美国）。人VEGF单克隆抗体(BD公司,美国)。 RNAiReady pSIRENRetroQ ZsGreen Vector(BD公司,美国)。
1.2方法
1.2.1人视网膜血管内皮细胞的培养 人视网膜血管内皮细胞(human retinal vascular endothelial cells,HRCECs)的培养参见文献进行[1]。角膜移植术后的废弃眼球，无菌下剪开眼球，取视网膜神经层，胰酶室温消化视网膜15min，再用0.66g/L Ⅱ型胶原酶消化30min，加入200mL/L胎牛血清的DMEM培养液终止消化，离心收集细胞，人内皮细胞培养液培养，培养瓶涂纤维连接蛋白，待细胞汇合单细胞层后，按1∶2传代，第Ⅷ因子相关抗原抗体鉴定内皮细胞。取3～6代的细胞进行实验,植入6孔板培养,分成实验组和对照组,每组6孔,实验组加入25mol/L的高糖培养，对照组加入等量的磷酸缓冲液对照。
1.2.2 P97在高糖培养的人视网膜血管内皮细胞中的表达 实时定量 PCR检测P97在高糖HRCECs的表达:使用Trizol分别抽提实验组和对照组的RNA，经Qiagen Rneasy Mini Kit纯化并DNase I柱上消化后定量质检。用Super Script II进行反转录合成cDNA。建立标准PCR反应体系,加入SYBR GreenⅠ荧光染料,采用Hotstar Taq Polymerase试剂盒，第一步95℃保温15min以激活Hotstar Taq Polymerase的活性。在循环过程中，在Step 3 @ 72℃, 退火温度为56℃，实时收集FAM/Sybr荧光信号，经过31个循环后72℃保温10min，然后进行融解曲线的分析。对比分析P97的mRNA的表达。引物如下：P97: 上游引物: 5’CTC CAT CAA GGG TCC TGA G3’，下游引物: 5’CCA ATG TTA CCT CCA CGA G3’ ；Betaactin：上游引物:CTT TTA GGA TGG CAA GGG ACT，下游引物:TGG AAC GGT GAA GGT GAC A。
1.2.3 RNAipSIRENP97的构建 干扰P97基因的RNA小片段双链及载体的构建方法参考文献进行[2],载体为RNAiReadypSIRENRetroQ ZsGreen Vector,插入的序列如下:5GATCCGACCTATCAACAGCCATTCTTCAAGAGAGAA TGGCTGTTGATAGGTCTTTTTTACGCGTG3,5AATTCACG CGTAAAAAAGACCTATCAACAGCCATTCTCTCTTGAAGAA TGGCTGTTGATAGGTCG3。
1.2.4转染RNAipSIRENP97到HRCECs 取3～6代的HRCECs进行实验，传代到6孔板内，分为A、B两个组，每组6孔, A组转染空白RNAipSIRENGREEN质粒为对照组, B组转染pSIRENP97质粒为实验组,实时定量PCR检测P97的表达,检测方法和引物与方法2相同。
1.2.5 P97对高糖培养HRCECs的血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响 Westen blot检测RNA干扰P97后VEGF的蛋白表达变化：分别提取高表达实验组和对照组HRCECs总蛋白,进行SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳,电转移至硝酸纤维素膜上。用VEGF单抗和二抗孵育后显影。比较实验组和对照组VEGF表达的差异, 利用JVC Ky2F30B 32CCD彩色图像摄录输入仪作图像分析,比较吸光度(A)值。
图1RNA干扰P97后对VEGF表达的影响（略）
1.2.6 P97对高糖培养的HRCECs增殖的影响 流式细胞仪检测A 和B两组HRCECs的细胞周期：A 和B两组每组取6孔HRCECs，胰酶消化，收集细胞，调整密度为106,700mL/L冷乙醇固定细胞，加入RNA酶，PI染色，流式细胞仪检测细胞生长周期。
统计学分析：运用SAS 6.12统计学软件，对转染组与对照组内皮细胞VEGF和P97的表达、以及HECECs增殖等实验数据进行方差分析和q检验，以P＜0.05为有统计学意义。
2结果
2.1 P97在高糖培养的人中HRCECs的表达 实时定量PCR检测P97在正常和高糖培养的HRCECs的mRNA水平的变化,结果表明: P97在正常组的P97/actin为0.73±0.08,高糖培养组为0.46±0.03,两组比较差异有显著性（P＜0.05)。
2.2 NAipSIRENP97抑制HRCECs的P97的表达 成功转染RNAipSIRENP97和空白RNAipSIRENGREEN到HRCECs，可见RNAipSIRENGREEN发出绿色萤光，实时定量PCR检测P97的mRNA水平，结果显示转染RNAipSIRENP97组的P97mRNA水平降低，转RNAipSIRENP97组：转空白RNAipSIRENGREEN组为0.26±0.02,0.55±0.04,两组比较差异有显著性（P＜0.05）。说明RNA干扰成功抑制了P97的表达。
2.3 RNAi干扰P97对高糖培养的HRCECs中VEGF表达的影响 Westen blot检测RNA干扰P97后HRCECs中VEGF的蛋白表达变化，结果表明，RNA干扰P97组（B组）的VEGF/actin为0.21±0.03,对照组为0.10±0.01 (图1),两组比较差异有显著性（P＜0.05），RNA干扰P97后VEGF的蛋白表达增高。
2.4 RNAi干扰P97对高糖培养的HRCECs增殖的作用RNA干扰P97组和对照组在G1期细胞分别为(44.0±3.6)%、(25.2±3.2)%，两组比较差异有显著性(P＜0.05）。说明P97表达下调促进内皮细胞的增殖，高表达P97能抑制内皮细胞的增殖。
3讨论
随着分子生物学技术的发展，遗传因素成为当前疾病研究的主要突破口之一，从遗传因素寻找DR相关基因已成为一条重要途径，特别是DR易感基因的研究近几年有很多新的发现[3],如PEDF基因的启动子多态性与DR的易感性相关；TGFbeta 的T869C 基因多态性可以增加糖尿病患者并发DR[4];还有研究认为VEGF、对氧磷脂酶等基因多态性与DR易感相关。我们从临床观察到糖尿病患者并发DR具有差异性，也认识到这一差异性与患者的遗传因素相关，但与众多的研究不同，我们将研究焦点集中在哪些不易并发DR的患者，寻找他们不易并发DR的原因。
在前面的研究中,我们先后寻找并研究了LRap、NTF2、P58IPK等基因[5]，并在此基础上初步理清了DR抵抗基因的研究思路,本研究正是在前面研究的基础上的进一步探索。从本文结果可知：P97在高糖培养的HRCECs中表达下调，而P97表达下调对HRCECs会带来怎样的影响?本文通过RNA干扰抑制P97的表达研究这一问题，发现当P97表达受抑制后，VEGF的表达增高，HRCECs的增殖增强，这些变化可能与DR的发生发展相关联。
相关的研究发现P97能调控细胞的增殖周期[6]，调控核转录因子κB 的表达[7]，P97参与内质网相关降解[8]，是泛素介导的蛋白酶降解过程中多泛素链上的标记因子, P97的缺失导致泛素蛋白酶体的抑制和泛素化蛋白的蓄积，最近有研究发现P97表达下降促使缺氧诱导因子HIF1alpha及其靶基因表达上调[9]:由于P97的减少,其诱导HIF1alpha经泛素蛋白酶体途径降解减少,导致HIF1alpha在细胞内表达增高,而HIF1alpha能导致VEGF等靶基因表达上调,引起细胞增殖和迁徙增加等相应的变化.结合我们的研究，我们认为：RNA干扰HRCECs的P97后，VEGF的表达增高可能正是这个途径所致。而HIF1alpha和VEGF在DR的发生发展过程中扮演至关重要的角色[10]，这些结果说明：当糖尿病患者体内P97高表达，能抑制HIF1alpha和VEGF等促进DR发生发展的因子的表达，从而对抗DR的发生发展。P97正是我们所要寻找的潜在的DR抵抗基因，我们将进一步研究其作用机制。
【参考文献】
1 Li B, Tang SB, Hu J, et al. Protective effects of transcription factor HESR1 on retinal vasculature. Microvascular Research2006:146152
2李斌，唐仕波，林少芬,等.RNA干扰HESR1基因质粒体的构建.眼科学报2005;21:112115
3张清，唐罗生.糖尿病视网膜病变相关基因多态性的研究进展.国际眼科杂志2008;8(1):126129
4 Buraczynska M, BaranowiczGaszczyk I, Borowicz E, et al. TGFbeta1 and TSC22 gene polymorphisms and susceptibility to microvascular complications in type 2 diabetes. Nephron Physiol2007;106:6975
5 Li B, Li D, Li GG, et al. P58IPK inhibition of endoplasmic reticulum stress in human retinal capillary endothelial cells in vitro. Molecular Vision 2008;14:11221128
6 Huyton T, Pye VE, Briggs LC, et al. The crystal structure of murine p97/VCP at 3.6A. J Struct Biol2003;144: 337348
7 Asai T, Tomita Y, Nakatsuka S, et al. VCP (p97) regulates NFkappaB signaling pathway, which is important for metastasis of osteosarcoma cell line. Jpn J Cancer Res2002;93:296304
8 Wójcik C, Rowicka M, Kudlicki A, et al. Valosincontaining protein (p97) is a regulator of endoplasmic reticulum stress and of the degradation of Nend rule and ubiquitinfusion degradation pathway substrates in mammalian cells. Mol Biol Cell2006;17:4606 4618
9 Alexandru G, Graumann J, Smith GT, et al. UBXD7 binds multiple ubiquitin ligases and implicates p97 in HIF1alpha turnover. Cell2008;134:804816
10张鹏，王雨生，韩者艺，等.缺氧对人视网膜色素上皮细胞表达缺氧诱导因子1α及血管内皮生长因子的影响.中华眼底病杂志2006;22:204206
|
