作者：张莉，蒋升，克麦儿·艾则孜
作者单位：830000）中国新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市，武警新疆总队医院眼科；（830054）中国新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市，新疆医科大学第一附属医院内分泌科
【摘要】 目的：探讨诱导型一氧化氮合酶（iNOS）在糖尿病大鼠视网膜组织中的表达及其对细胞凋亡的影响。方法:建立糖尿病大鼠动物模型，分别在成模后第1,3,6mo时测定大鼠视网膜组织细胞凋亡指数（AI）和iNOS表达水平。结果：（1）与正常对照组（NC）相比，iNOS表达在糖尿病各组均升高，6mo时明显增强（P<0.05）；（2）视网膜细胞凋亡情况：与正常对照组（NC）相比，糖尿病模型1mo时细胞凋亡指数差异无统计学意义，3,6mo时则明显升高（P<0.05）。结论：iNOS在糖尿病大鼠视网膜组织中的表达增强，推断iNOS在糖尿病视网膜病变（retinopathy of diabetes,DR）的发病机制中起一定作用。
【关键词】 诱导型一氧化氮合酶；糖尿病视网膜病变；凋亡
Expression of iNOS of retina in diabetic rats and its relationship with apoptosis of retina
Li Zhang, Sheng Jiang, Aizezi Kemaier
Department of Ophthalmology, General Army Hospital of Armed Police, Urumchi 830000, Xianjiang Uygur Autonomous Region, China;Department of Endocrinology, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumchi 830054, Xianjiang Uygur Autonomous Region, China
Abstract AIM: To investigate the expression of inducible nitric oxide (iNOS) and its effection on the apoptosis of retina in diabetic rats. METHODS: The model of diabetes was induced by streptozotocin. The apoptotic index (AI) of retina and iNOS were observed at 1, 3 and 6 months during the experiment, respectively.RESULTS: The expression of iNOS of retina in diabetic rats was markedly higher than NC in 6month group (P<0.05). Compared with NC, AI was significantly higher in 3 and 6month groups (P<0.05). Compared with NC, AI had no significantly difference in 1month group.CONCLUSION: The expression of iNOS of retina in diabetic rats is higher. It may act an important role in the retinopathy of diabetes.
KEYWORDS: inducible nitric oxide; retinopathy of diabetes; apoptosis
糖尿病视网膜病变（retinopathy of diabetes, DR）是糖尿病最常见的并发症及世界范围内致盲的主要疾病之一，其主要病理过程为新生血管形成及增殖。一氧化氮(NO)是一种内源性血管扩张剂和神经递质，在视网膜血流的调控机制和DR的发生发展中起重要作用，作为体内NO生成的主要限速因素，iNOS在DR形成中的作用也日益受到关注[1，2]，本研究旨在探讨糖尿病大鼠视网膜组织内iNOS的表达及其与细胞凋亡的关系，以期进一步阐述DR的发病机制，从而寻求新的防治办法，改善DR患者的预后。
1材料和方法
1.1材料 实验用纯系Wistar雄性大鼠50只，血糖（3.4±0.52）mmol/L，月龄10～14wk，体质量220～350ｇ，由新疆地方病研究所实验动物中心提供。实验动物喂养于新疆医科大学实验动物中心标准化饲养房，并饲以普通颗粒饲料（新疆医科大学实验动物中心提供）。
1.2方法
1.2.1动物模型制备及分组 诱导剂为链脲佐菌素（STZ，Sigma公司提供）。STZ临用前以0.1mol/L，pH 4.2的柠檬酸钠缓冲溶液配制成10g/L的溶液，按STZ 60mg/kg体质量一次性腹腔内注射。注射后监测空腹血糖(应用罗氏公司优越微量血糖测定仪和血糖试纸检测)，以空腹血糖≥16.67mmol/L，稳定7d以上为糖尿病大鼠模型。40只予以注射STZ，33只血糖达到标准，正常对照组（10只）腹腔注射等体积柠檬酸缓冲液。将33只糖尿病鼠随机分为3组：糖尿病1mo组（DM1），糖尿病3mo组（DM3）和糖尿病6mo组（DM6）。分别于实验第1，3，6mo时检测相关指标，NC组与DM6组同时检测。研究期间每周监测体质量与空腹尾血血糖1次。
1.2.2 iNOS免疫组织化学染色及测定 分别在第1,3,6mo末处死大鼠，分离视网膜（每组大鼠随机分离5眼），置于40g/L多聚甲醛固定3～4h，后入4℃ 200g/L蔗糖至标本沉底。将视网膜组织连续冰冻切片，片厚5μm。采用SP法进行免疫组织化学染色(冰冻切片漂浮法)。显色满意后，终止显色，脱水、透明、中性树脂封片，显微镜下观察。细胞胞质被染成棕黄色或黄色者为iNOS表达阳性细胞。测定标本阳性表达产物的平均吸光度，平均吸光度代表染色强度，反映iNOS的相对含量。试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，实验步骤按试剂盒说明。分光光度计(722型，上海精密仪器有限公司分析仪器厂)。
表1各组大鼠最终体质量、血糖、凋亡指数及iNOS的变化（略）
aP<0.05 vs NC组
1.2.3视网膜细胞凋亡检测(TUNEL法) 按试剂盒说明操作（美国promega公司），大鼠视网膜组织切片脱蜡、水化后入40g/L多聚甲醛15min，蛋白酶K消化12min，40g/L多聚甲醛5min，加Equilibration Buffer 10min，加标记液2H，30mL/L H2O2 4min，加streptavidin HRP 20min，DAB染色。细胞核中有棕色颗粒者为凋亡细胞，5眼中各随机取1个视野，用病理图象分析仪采集标准面积图像，对每个图像的阳性细胞及总细胞进行计数，AI为阳性细胞数与总细胞数的比值，最后求5个视野AI的平均值，以此反映其凋亡发生的情况。
统计学处理：所有数据用±s表示，数据处理采用SPSS 13.0统计软件进行，数据采用方差分析和t检验。
2结果
2.1 iNOS表达情况 NC组视网膜iNOS表达很低，糖尿病各组视网膜均发现iNOS表达的棕黄色阳性染色，在DM6组表达量最高，明显高于其他实验组（P<0.05，表1）。
2.2视网膜细胞凋亡情况 与正常对照组（NC）相比，糖尿病模型1mo时细胞凋亡指数差异无统计学意义，3,6mo时则明显升高（P<0.05,表1）。
2.3大鼠体质量、血糖的变化 糖尿病大鼠在实验期间血糖保持稳定，均在16.67mmol/L以上。与NC比较，各组大鼠最终体质量、血糖差异显著（P<0.05，表1）。
3讨论
iNOS存在于多种细胞，以神经胶质和巨噬细胞为主，其次是神经元细胞。iNOS是体内一氧化氮（NO）生成的主要限速因素，正常情况下iNOS在视网膜表达量很少，而在病理状态下可被激活，高糖刺激可以导致视网膜细胞中iNOS的表达增加，导致NO生成增加，内源性或外源性NO的过量产生和释放则具有细胞毒性和细胞抑制作用，尤其是源于iNOS的过度表达而产生的NO[3]。糖尿病时体内很多组织中iNOS表达增强[4]。在糖尿病视网膜中，iNOS的表达主要分布于视网膜神经纤维层(NFL)、神经节细胞层(GCL)和内颗粒层(INL)，而此处细胞是维系视网膜血管结构重要的神经胶质细胞。
本研究显示，iNOS在正常大鼠视网膜组织中表达较少，在糖尿病大鼠表达增多，由此可推测iNOS产生过多的NO有可能对血管造成损伤。而且，随着糖尿病病程的延长，糖尿病大鼠视网膜细胞AI逐渐上升，提示细胞凋亡的增加可能与iNOS的过量表达有关。iNOS被诱导表达后,NO的合成大大增加,导致线粒体钙离子内流增加，质膜上的钙泵失效，形成钙超载、线粒体超氧化物歧化酶活性降低、氧自由基大量聚集、造成线粒体质膜脂质过氧化和通透性增加[5]。同时，NO及其产物过氧亚硝酸盐是线粒体中电子传递链复合物I和IV的抑制物，致使ATP的生成迅速减少，钠钾泵功能障碍，导致细胞的损伤[6]。另外，iNOS表达增强可导致白细胞淤滞和视网膜血管通透性增强，细胞间黏附因子表达上调，视网膜屏障出现障碍[7]。糖尿病发展所导致的缺氧缺血等又可使体内的细胞因子如IL1β、γ干扰素(IFNγ)等升高并激活iNOS基因启动子转录,启动iNOS的表达；糖尿病时体内氧化应激反应增强，也使iNOS表达增强；产生一系列自由基引起的氧化及硝化损伤。这在视网膜神经元以及血管的结构与代谢方面产生损伤作用，从而加速DR的进展。
本研究中糖尿病大鼠视网膜组织中iNOS表达增强，且随着病程增加而升高，同时，AI逐渐升高，提示DR可能与iNOS的过量表达有关。所以，早期使用iNOS抑制剂可能使视网膜血流及血管通透性改善，对于预防或延缓DR的发生和发展有一定作用。
【参考文献】
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3 Lechner M, Lirk P, Rieder J. Inducible nitric oxide synthase (iNOS) in tumor biology:the two sides of the same coin. Semin Cancer Biol 2005;15(4):277289
4 Giove TJ, Marbach CS, Eldred WD. Alterations in Neuronal and Inducible Nitric Oxide Synthase in the Diabetic Mouse Retina. Invest Ophthalmol Vis Sci2007;48:49 68
5 Leal EC, Ayyakkannu M, Hosoya KI, et al. Invest.Inducible Nitric Oxide Synthase Isoform Is a Key Mediator of Leukostasis and BloodRetinal Barrier Breakdown in Diabetic Retinopathy. Ophthalmology2007;48(11):52575265
6张琼,张士胜,王玲.一氧化氮与血管生成的研究进展.国际眼科杂志2007；7(3):788790
7 Zakula Z, Koricanac G, Putnikovic B, et al. Regulation of the inducible nitric oxide synthase and sodium pump in type 1 diabetes. Med Hypotheses2007;69(2):302306
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