作者：杨玉洁,高晓唯,任兵
作者单位：(832002) 中国新疆维吾尔自治区石河子市, 石河子大学医学院; (830011) 中国新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市, 解放军474 医院眼科医院
【摘要】随着现代眼科学的发展，角膜保存技术取得了重大进步，使角膜保存质量提高，保存时间明显延长。本文复习了目前常用的各种角膜保存方法，同时对角膜保存的热点问题：角膜保存的免疫原性，细胞凋亡，角膜内皮、上皮细胞的保护，需氧量，污染控制等方面作了综述，最后，我们对未来的发展趋势进行展望。
【关键词】 角膜；角膜内皮细胞；保存
Advances in the study of corneal preservation
YuJie Yang, XiaoWei Gao, Bing Ren
Graduate School of Medical College, Shihezi University, Shihezi 832002, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; Center of Ophthalmology, No. 474 Hospital of Chinese PLA, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Abstract
With the development of modern ophthalmology, the corneal preservation technology has obtained considerable improvement: the quality has been obviously improved and the time of storage prolonged a lot. We reviewed the recent status of the corneal preserving media as well as the currently hot subjects of research, including immunogenicity, apoptosis, protection of corneal endothelium and epithelium, oxygen requirement and pollution control in corneal storage. At last, we made some expectation on the future research.
KEYWORDS: cornea; preservation
0引言
1906年Zerm利用新鲜供体首次将穿透性角膜移植应用于人眼，自此角膜移植术不断发展。在其广泛应用推广的过程中，角膜保存技术也不断改进和创新，为角膜移植提供了良好的前提，并增加了移植的有效性；而角膜移植手术的不断开展和完善也对供体角膜保存技术提出了更高要求。现对目前常用角膜保存技术及研究热点综述如下。角膜保存方法据其对角膜内皮细胞（corneal epithelial cells,CEC)的活性分为活性保存和非活性保存;根据对CEC活性的保存时间分为短、中、中长和较长期保存[1]。
1活性保存
1953年,Stocker发现CEC是维持角膜透明的基础, 因此角膜保存的关键是保护CEC，这一发现为后来的角膜保存技术确立了质量标准及研究方向, 也使角膜保存由原来的非活性保存转变为活性保存。活性保存能使CEC存活率达到70%以上，可用于穿透性角膜移植。
1.1短期保存法 短期保存法即湿房保存（moist chamber storage，MCS）是将全眼球消毒处理后在湿房内4℃保存，仍是许多眼库运用最多的角膜短期保存方法。优点是简便、经济，但受保存时间限制, 一般只能保存24～48h，因此该方法难以达到现代眼库必须对供体组织进行HLA 配型、HIV、肝炎病毒筛选的科学要求，容易导致手术失败, 并增加移植传染的几率。陈家琪等[2]抽空房水，前房注入灭菌空气，获得了较好的CEC活性，但空气充填前房易弥散消失，前房和眼压不稳定，后改用C3F8充填前房，进行MCS保存取得更为满意的内皮活性保存效果。汤爱菊等在此基础上以肾胺、低分子右旋糖酐等混合液做为湿房, 保存6d CEC活性率达90% 以上。随着现代眼库的发展, 在降低房水毒性或前房注入对CEC有营养的液体后,期待MCS的保存时间更加延长。
1.2中期保存液保存 中期保存液保存(preservation of intermediate term corneal medium) 是用活性保存液4℃低温条件下使CEC活性保持4～14d,以至更长时间的方法。1973年美国McCary和Kaufman发明了第一代角膜保存液，即MK液，开创了角膜中期保存的先河。其方法简单、经济，效果可靠，但保存时间有限，一般认为4d以内效果最佳。随后许多学者在MK液基础上进行改进，加入硫酸软骨素(CS)和HEPES缓冲系统，经过改进，角膜保存液可有效保存10～14d，其代表是K5O1，CSM，Dexsol液。1990年Kaufman和Lindstrom研制出新一代Optisol角膜中期保存液，是目前公认的较理想的保存液。杨娟等[3]研究发现在改良MK液中加入透明质酸钠可延长角膜保存时间，保存效果与透明质酸钠浓度有关。于莉等[4]研究认为，透明质酸钠及抗氧化剂具有减轻角膜组织损伤、保持细胞活性的作用，将二者联合应用于角膜中期保存液中，可显著提高保存效果。邹文进等［5］研制的角膜中期保存液以细胞培养基M199为基础液，加入25g/L硫酸软骨素、10g/L低分子右旋糖酐、100mL/L特级胎牛血清、1mmol/L丙酮酸钠、1g/L妥布霉素、25mmol/L HEPES。台盼蓝和茜素红联合染色及扫描电镜显微结构检查，证实其保存角膜的效果与Optisol液相当。阎超等[6]研究发现碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)在角膜中期保存液中均有促进细胞增殖、保持角膜细胞活性的作用，以bFGF作用更明显。徐智勇等[7]研究发现加入bFGF实验组保存角膜，角膜水肿较轻、皱褶较少、透明度较高，角膜内皮细胞形态结构和活性较好；并且角膜上皮、基质和内皮层有PCNA（单克隆抗增殖细胞核抗原）阳性细胞，与对照组比较差异显著，研究认为bFGF可应用于中期角膜保存。另外，该研究还对角膜中期保存液中bFGF的不同质量浓度对保存角膜细胞活性的影响作了进一步分析，结果发现兔角膜中期保存液中添加bFGF的质量浓度以20～50mg/L为宜[8]。
1.3中长期保存 中长期保存即器官培养（organ culture）是用模拟角膜生理环境的组织培养液，在近似角膜生理温度条件下30～37℃(欧洲普遍采用34℃) 提供角膜必需的营养和条件来保存角膜，能较好地维持角膜的代谢,有利于CEC创伤修复, 确保CEC活性达4～5wk。由于保存周期较长，医生能进行HLA 配型、HIV 、肝炎病毒筛选, 保存结束时还可常规检查内皮，故能随时抛弃不合格的供体。使用器官培养液的一个缺点是保存期间角膜水肿，因此必须在角膜移植术前使角膜脱水，而角膜水肿和脱水过程中可导致角膜内皮细胞损伤。HES130羟乙基淀粉作为一种合成的胶质，在器官培养液中能预防角膜水肿，而不损伤内皮细胞，它将改进目前的器官培养液［9］。Zhao等[10]研究发现, 使用聚羟体(poloxamers)能够退除器官培养角膜间质的肿胀、减少间质部分的折叠、改善其透明度；虽然聚羟体对保存角膜仍有轻度损伤，但是其作用明显优于葡聚糖T500。值得注意的是，器官培养法需要在34℃环境中经常更换培养液，容易造成污染而致保存失败,且对设备及检测技术要求较高、操作复杂，目前在我国难以推广。
1.4长期保存 长期保存即深低温保存（cryopreservation） 是将角膜在冷冻剂保护下, 控速降温到80℃, 然后贮存于196℃液氮中, 待用时复温取出，可保存1a以上。深低温下可完全抑制细胞的能量代谢, 使之呈“休眠状态”而避免代谢产物积聚和微生物繁殖。由于深低温保存的角膜期限长、细胞活性接近新鲜角膜,用于穿透角膜移植术后透明率与新鲜角膜相仿且能随时提供移植材料，是眼库长期保存角膜的理想方法之一。其中应用程序对降温速度的控制和角膜的复温是关键因素，王丽娅等[11]在Capella和Kaufman提出的四步法冷冻保存的基础上确定了两阶段保存法：第一阶段降温速度为2.0℃/min、第二阶段降温速度为5.0℃/min作为最佳降温程序,且用40℃水浴复温不仅能够使角膜冻存液快速溶解、冰晶迅速融化,而且也不会因为温度的问题而损伤角膜细胞，此法能使角膜内皮细胞存活率达到70%以上。近年对冷冻保护剂研究发现, 二甲亚砜、丙二醇、甘油、CS均能使角膜细胞获得玻璃化作用, 减少冰晶的发生。Rauen等[12]研究发现培养的猪CEC在低温条件下遭受强烈的铁依赖性损伤，这种低温诱导的损伤可能是CEC在低温保存条件下发生损伤的重要机制，因此可使用铁鏊合剂等进行干预治疗。
2非活性保存
非活性保存(nonviability preservation)是一种防腐保存，分为干燥保存、冷冻保存等，是通过对角膜加工处理，使角膜组织内移去水分，阻止细胞酶失活，抑制组织细胞自溶，从而保持组织细胞的完整性。干燥保存常用的脱水干燥剂有变色硅胶、分子筛、无水氯化钙及甘油。冷冻保存是将全眼球直接浸入液氮，快速冷冻保存。多数学者认为非活性保存材料只能用于板层角膜移植，因为板层角膜移植所需要的材料不要求内皮细胞具有活性，只要具有完整胶原板层结构就能使用,植片移植后只能充当一个支架组织。但近年关于干燥保存角膜的实验和临床应用研究认为干燥保存和冷冻保存复温后角膜CEC核存在，无核溶解现象，胞质内细胞器存在，细胞具有明显活性标志，并用于治疗性穿透性角膜移植和光学性板层角膜移植，部分植片能获得透明，且真空冷冻干燥和保存的兔角膜复水后，CEC密度为(2339±205.73)个/mm2，存活率为78.57%[13]，但该结论有待深入观察研究。杨宏伟等[14]研究认为，真空冷冻干燥保存法可使离体角膜组织保持一定活性，与新鲜及冷冻角膜相比，冻干法有望成为一种新的角膜长期保存法。
3角膜保存研究热点问题
3.1角膜保存的免疫原性(immunogenicity) 角膜移植免疫排斥反应是手术失败的首要原因，因此在植片保存过程中，探索能否既保存CEC活性，又降低植片抗原性，从而降低角移植排斥反应发生率是研究重点。角膜Langerhans细胞（LCS）具有很强的抗原递呈功能，与免疫排斥反应的发生十分密切。Peeler等报道减少或去除供体的LCS，可以减弱抗原的直接递呈过程和植片的免疫原性，减少排斥反应的发生。用器官培养方法保存角膜可以减少LCS，移植后排斥率也大大降低[15]。蓝平等通过程序降温深低温冻存角膜植片降低了角膜抗原性，推测是角膜的LCS在直接冷冻保存过程中失活，从而降低角膜抗原性。
3.2角膜保存过程中的细胞凋亡 细胞凋亡(apoptosis)是一种程序性细胞死亡，在维持正常组织器官稳定及病理状态组织器官损伤修复中起着重要作用。角膜保存过程中细胞凋亡是细胞丧失机制之一，且凋亡与保存时间正相关。Albon等[16]用TUNEL、hoechst染色和anticasPase3活性抗体免疫标记，对34℃器官培养人CEC凋亡测定认为CEC凋亡数量和分布与角膜水肿皱褶有关，并直接影响了保存CEC的质量。而角膜水肿是由于CEC的Y型连接缝隙增宽，F肌动蛋白和CEC的顶端连接复合体、细胞骨架断裂而致CEC功能丧失，提出抑制角膜基质水肿将有利于预防CEC凋亡从而改善保存角膜的质量。徐志勇等[17]在中期保存液中加入碱性成纤维生长因子bFGF(10mg/L)，发现bFGF有抑制和减轻角膜细胞凋亡发生，保持角膜细胞结构和功能的作用。Raeder等[18]研究发现，在室温条件下（23℃）进行器官培养储存，人类角膜缘上皮细胞（HLECs）能够最低限度的控制细胞凋亡，效果要优于31℃器官培养法和OPtisolGS液5℃保存法。通过对保存角膜细胞凋亡发生机制深入研究，运用有效手段抑制凋亡，将大大减少活性细胞的丧失，提高保存角膜的质量。
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