体外培养兔晶状体上皮细胞胞间通讯的研究
 
　　中华眼科杂志 2000年第2期第36卷 白内障

　　作者：李朝辉　何守志　李楠　杨军

　　单位：李朝辉（100853 北京，解放军总医院眼科）；何守志（100853 北京，解放军总医院眼科）；李楠（仪器中心）；杨军（仪器中心）

　　关键词：晶状体；胞间通讯；地塞米松；肝素

　　【摘要】　目的　应用荧光淬灭后恢复(fluorescence redistribution after photoblea
　　ching, FRAP)技术研究兔晶状体上皮细胞胞间通讯，以及地塞米松和肝素对兔晶状体上皮细胞胞间通讯的影响。方法将体外培养兔晶状体上皮细胞接种于96孔板，培养24 h后分别加入地塞米松(浓度分别为10、100、300 mg/L)和肝素（浓度分别为1×105、2×105、4×105 U/L）。各组加入药物后，于37℃继续培养48 h，以羧基荧光素乙酰乙酸盐（6-carboxy fluorescein diacetate,CFDA）作荧光染色。以激光扫描仪（ACAS Ultima）进行光淬灭并测定平均荧光恢复速率（mean fluorescence redistribution rate,MFRR）。结果　地塞米松组，细胞内荧光淬灭后，平均荧光恢复速率（%/min）分别为：对照组0.375±0.236，10 mg/L组0.491±0.239，100 mg/L组0.966±0.447，300 mg/L组0.984±0.379(F=26.07，P＜0.05)；肝素组，平均荧光恢复速率（%/min）分别为：对照组0.375±0.236，1×105 U/L组0.694±0.491，2×105 U/L组1.097±0.504，4×105 U/L组1.082±0.501(F=19.01，P＜0.05)。提示地塞米松和肝素可增强兔晶状体上皮细胞间的通讯，其作用与二者剂量有关。结论　应用FRAP技术证实兔晶状体上皮细胞间存在胞间通讯，地塞米松和肝素对兔晶状体上皮细胞胞间通讯有增强作用，其增强作用与剂量有依赖关系。
 
　　Studies on intercellular communication of rabbit lens epithelial cells in vitro
LI Zhaohui, HE Shouzhi, LI Nan, et al.
　　（Department of Ophthalmology, the PLA General Hospital, Beijing 100853, China）

　　【Abstract】　Objective　To investigate the intercellular communication in rabbit lens epithelial cells and effect of dexamethasone and heparin on it. Methods　Rabbit lens epithelial cells were cultured and exposed to different concentrations of dexamethasone (10, 100, 300 mg/L), heparin (1×105, 2×105, 4×105 U/L) for 48 hours at 37℃. The fluorescence redistribution after photobleaching (FRAP) was used for the analysis. The mean fluorescence recovery rate (MFRR, %/min) of the cells labelled with 6-carboxy fluorescein diacetate (CFDA) after photobleaching was measured with laser scanning cytometry ACAS Ultima. Results　MFRR (%/min) of the cells after exposure to dexamethasone was 0.375±0.236 in the control group, 0.491±0.239 in the group of dexamethasone 10 mg/L, 0.996±0.447 in the group of dexamethasone 100 mg/L, 0.984±0.379 in the group of dexamethasone 300 mg/L, respectively (F=26.07, P＜0.05). The MFRR after exposure of heparin was 0.375±0.236 in the control group, 0.694±0.491 in the group of heparin 1×105 U/L, 1.097±0.504 in the group of heparin 2×105 U/L , 1.082±0.501 in the group of heparin 4×105 U/L, respectively (F=19.01, P＜0.05). Conclusion　It is discovered that there is intercellular communication in rabbit lens epithelial cells with FRAP analysis. Dexamethasone and heaprin can enhance the intercellular communication of rabbit lens epithelial cells in dose dependent manner.

　　【Key words】　Lens；　Intercellular communication；　Dexamethasone；　Heparin

　　有实验证据表明，白内障囊外摘除术后，晶状体后囊混浊的发生率不仅取决于囊膜残存上皮细胞的数量，也与细胞接触抑制的解除刺激有关［1］。在此生物学过程中，细胞间是通过缝隙连接相互影响和相互调控，即所谓细胞间通讯。缝隙连接是相邻接细胞之间的一类蛋白通道，可允许一些离子及小分子物质自由通过。缝隙连接介导的胞间通讯，通过细胞与细胞之间代谢物及某些信号分子的转换而参与对细胞生长、组织器官发育及细胞分化的调控［2］。此外，这种细胞之间的物质交流可使细胞对于外环境的改变产生适应性变化，从而在维持细胞、组织乃至机体的自身稳定方面起重要作用［3］。

　　晶状体上皮细胞间缝隙连接介导的细胞间通讯，对晶状体上皮细胞的生长、分化等起调控作用。为了进一步了解胞间通讯特性及其影响因素，本实验应用激光扫描细胞仪和荧光淬灭后恢复(fluorescence redistribution after photobleacing, FRAP)技术对培养的兔晶状体上皮细胞胞间通讯及地塞米松和肝素对胞间通讯的影响进行研究，现将结果报告如下。

　　材料和方法

　　一、仪器

　　我们使用ACAS Ultima型激光扫描共聚焦显微成像仪（美国MERIDIEN Inc产品），对活细胞的荧光强度实时定量检测。

　　二、细胞培养

　　取健康2月生新西兰白兔1只，静脉空气栓塞处死后无菌下取出眼球，超净台中将晶状体囊膜切成1 mm×1 mm的植片，贴在25 ml培养瓶内壁，加入PRMI 1640培养液培养。3 d换液一次。细胞长满融合后，用0.02% EDTA-0.25%胰酶消化传代。细胞生长稳定后，取生长良好的细胞，用0.02% EDTA-0.25%胰酶消化20 s后，加入Hank液吹打，离心管离心，记数，分别接种于96孔板中，每孔约1×104个细胞，置37℃培养24 h后，弃去培养液，分别加入含地塞米松10、100、300 mg/L，肝素1×105、2×105、4×105 U/L的培养液，每种药物浓度6孔，并设对照6孔，置37℃培养，48 h后进行检测。

　　三、羧基荧光素乙酰乙酸盐(6-carboxy fluorescein diacetate,CFDA)的负载

　　CFDA粉剂溶于二甲基亚砜中配成1 g/L的储存液，-20℃保存。染色时用含有Ca2+、Mg2+的PBS稀释。将培养的细胞用含Ca2+、Mg2+的PBS清洗2次，加入10 μg CFDA（终浓度）于50 μl PBS中，在37℃、体积分数为0.05的CO2孵箱中孵育15 min，弃去CFDA，然后再加入少量培养液。

　　四、FRAP技术

　　经CFDA负载的细胞用激光扫描聚焦显微镜检测，初始的扫描可用于确定光淬灭前的荧光水平。每孔选择8～10个细胞，进行光淬灭。在每孔中另选择一个单个细胞不进行光淬灭，用作背景荧光校正。本实验检测时间为13.5 min。

　　FRAP实验的结果，以荧光恢复的速率平均百分数加平均数的标准误表示。恢复速率以每个检测细胞荧光值与初始淬灭前荧光值相比所得的百分率计算。

　　五、统计学方法

　　数据统计采用SAS软件方差分析及q检验的方法进行处理。

　　结果

　　一、地塞米松对晶状体上皮细胞胞间通讯的影响
　　对照组细胞及不同浓度地塞米松组细胞光淬灭后荧光恢复速率见表1。经q检验，荧光恢复速率对照组细胞为0.375 %/min，加入地塞米松48 h后，10 mg/L组荧光恢复速率虽有一定程度的增加，但与对照组比较，差异无显著性（P＞0.05）；而100 mg/L组与300 mg/L组其荧光恢复速率较对照组有明显增加，两组与对照组比较差异有显著性（P＜0.05），结果显示地塞米松可增强晶状体上皮细胞间的通讯，其作用与地塞米松剂量有一定关系。

　　二、肝素对晶状体上皮细胞胞间通讯的影响 

　　不同浓度肝素作用组细胞光淬灭后荧光恢复速率见表2。经q检验，荧光恢复速率对照组细胞为0.375 %/min，加入肝素48 h后各组较对照组荧光恢复速率有不同程度的增加，各组与对照组比较差异有显著性（P＜0.05），而2×105 U/L组和4×105 U/L组增加幅度较1×105 U/L组更大，两组与1×105 U/L 组比较差异有显著性（P＜0.05）。

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