转化生长因子-β1诱导培养的人眼小梁细胞产生弹性蛋白的实验研究

　　中华眼科杂志 1999年第5期第35卷 论　著

　　作者：钟丽春　李美玉

　　单位：100034 北京医科大学第一医院眼科

　　关键词：小梁网；细胞；培养的；转化生长因子-β；弹性蛋白；青光眼；开角型

　　【摘要】　目的　了解转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导培养的人眼小梁细胞产生的弹性蛋白。探讨房水引流阻力在原发性开角型青光眼(primary%26127;open angle glaucoma,POAG)的病因和发病机制中的作用。方法　小梁网来源于除眼部疾患外的各种原因死亡的6岁以下儿童，在24 h内取材于6例(12只眼)正常眼球。人眼小梁细胞原代和传代培养。用光镜和电镜观察培养细胞，用免疫组织化学S-P法染色，检测细胞外基质，包括层粘连蛋白(laminin,LN)和Ⅳ型胶原(Ⅳcollagen,ⅣC)。用免疫蛋白印迹法(Western blotting)检测细胞培养液中的弹性蛋白。结果　根据培养细胞的生长特性、形态特征及细胞外基质(LN和ⅣC)染色特点等确定培养的细胞为人眼小梁细胞。TGF-β1组检测出弹性蛋白，对照组和中和抗体组未检测出弹性蛋白。结论　TGF-β1诱导培养的人眼小梁细胞产生弹性蛋白,TGF-β1中和抗体可拮抗此作用。小梁网中弹性蛋白增多，加重小梁网细胞外基质堆积，使房水引流阻力增加，可导致POAG发生。
 
　　Transforming growth factor-β1 induced cultured human trabecular cells to produce elastin
ZHONG Lichun, LI Meiyu.

　　department of Ophthalmology, First School of Clinical Medicine, Beijing Medical university, Beijing 100034

　　【Abstract】　Objective　To understand transforming growth factor-β1 (TGF-β1) inducing cultured human trabecular cells (HTCs) to produce elastin and to approach the effect of resistance of aqueous outflow in the pathogenesis and mechanism of primary open angle glaucoma (POAG).Methods　Trabecular meshwork′s specimens were collected from twelve normal eyeballs of six human donors under six years of age within 24 hours after death. HTCs were primarily cultured and subcultured. Cultured cells were observed under light and electron microscopes. Laminin (LN) and IV collagen (IV C) in extracellular matrix (ECM) were immunohistochemically stained by S-P method. The third passage confluent cells after two weeks were divided into three groups: control group, TGF-β1 group and neutralizing antibody of TGF-β1 group. Concentration of neutralizing antibody of TGF-β1 was 30 μg/ml. After culturing for two weeks, elastin in the media of three groups was respectively determined by western blotting from sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis using anti-human aortic α-elastin rabbit serum, biotin conjugated goat anti-rabbit IgG and anti-biotin conjugated horse radish peroxidase.Results　Cultured hTCs were identified from cultured cell's growing characteristics, morphological features under light and electron microscopes, and stained peculiarities of LN and IV C in ECM. With western blotting, elastin in the control group was not detected, elastin in TGF-β1 group was detected, and elastin in neutralizing antibody of TGF-β1 group was not detected. conclusion　TGF-β1 induces cultured HTCs to produce elastin, which the neutralizing antibody of elastin can antagonize; the increase of the amount of elastin may aggravate its stacking in ECM and increase the resistance of aqueous outflow in trabecular meshwork, leading to the occurrence of glaucoma.

　　【Key words】　Trabecular meshwork　　Cells, cultured　　Transforming growth factor-β　　Elastin　　Glaucoma, open angle

　　原发性开角型青光眼(primary open angle glaucoma,POAG)是致盲的主要疾病之一，POAG的视神经损害是由于小梁网房水引流阻力增加使眼压升高所致。小梁网细胞外基质的质与量异常造成小梁网孔变窄或阻塞,使房水引流阻力增加。小梁网细胞外基质主要由小梁细胞合成和分泌的各种蛋白质组成。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是活跃于眼部的多肽细胞生长因子，推测TGF-β1可能参与小梁细胞合成与分泌细胞外基质蛋白等生理活动和病理活动，从而影响房水引流阻力。

　　材料与方法

　　一、标本来源

　　选择除眼部疾患外，因其他原因死亡的6例（12只眼）6岁以下儿童眼球，在24 h内取材。

　　二、人眼小梁细胞体外培养和培养细胞的光镜与电镜标本制备

　　在实体显微镜下找到Schwalbe线和巩膜嵴即小梁网的前后界,用玻璃针插入Schlemm管内，在玻璃针与巩膜嵴之间环形切开Schlemm管,从 schwalbe线分离下小梁网，将小梁网组织块原代培养，胰蛋白酶消化，传代培养。传3代汇合前和汇合后细胞分别做细胞铺片，常规制备电镜标本，进行Wright-Giemsa染色和细胞外基质包括层粘连蛋白(laminin,LN) 和Ⅳ型胶原(Ⅳ collagen,Ⅳ C)的免疫组化S-P法染色，在光镜和电镜下观察。
 
　　三、弹性蛋白的检测(Western blotting)

　　将传3代汇合后2周的小梁细胞分为3组：对照组、TGF-β1组及中和抗体组。对照组不加TGF-β1，TGF-β1组加入TGF-β1的浓度为1×10-6μg/L,中和抗体组加入TGF-β1的浓度为1×10-6μg/L，加入TGF-β1中和抗体的浓度为0.3μg/L。各组小梁细胞在加入TGF-β1后，作用2周，再收集培养液，离心后点样，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和转移电泳，将其蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，在氨基黑中漂膜染色，水洗膜，用3%脱脂乳液或0.1 mol/L PBS-Tween混合液洗膜，依次加入1∶100抗人主动脉α-弹性蛋白兔血清、连接生物素的羊抗兔IgG和抗生物素蛋白－辣根过氧化物酶,分别摇动后洗膜，用二氨基联苯胺显色［1］。

　　结　果

　　一、培养细胞的细胞鉴定

　　原代培养6～28天的细胞从组织块向外生长，6～8周细胞围绕组织块形成单细胞层。传代培养24h后多数细胞已贴壁生长，2或3周后细胞汇合形成单细胞层；汇合后细胞形态均匀一致且数量恒定，可稳定生长1或2个月，如果2个月后不再传代，细胞将开始降解。传8代后,细胞生长增殖能力减弱，一般可传8或9代。光镜下观察，汇合前细胞形态呈三角形或梭形；汇合后细胞形成单细胞层，胞突重叠而胞体不重叠。扫描电镜下观察，细胞表面可见到分布均匀的短状微绒毛和包涵体小囊突起，胞突分枝彼此连接。透射电镜下可见各种细胞器,核膜不明显，有黑色峰带状楔形异染色质分布在核膜内侧。细胞外基质的免疫组化S-P法染色显示LN和ⅣC阳性。综上所述,从培养细胞的生长特性、%26127;形态特征及细胞外基质LN和ⅣC染色等特点，可确定培养的细胞为人眼小梁细胞。
 
　　二、Western blotting检测弹性蛋白

　　TGF-β1组检测出弹性蛋白，对照组和中和抗体组未检测出弹性蛋白。结果表明TGF-β1可诱导培养的人眼小梁细胞产生弹性蛋白,TGF-β1中和抗体可拮抗此作用。

　　讨　论

　　一、细胞外基质与房水引流阻力

　　POAG的病因和发病机制尚不清楚，近来研究表明POAG是由于小梁网房水引流阻力增加所致，这与小梁细胞的功能活动密切相关。一方面是小梁细胞收缩与运动功能异常，吞噬和清除房水流出道中有形成分及转运房水的能力下降；另一方面是小梁细胞合成和分泌功能异常，引起小梁网细胞外基质堆积。二者均导致小梁网孔变窄或阻塞,引起房水引流阻力增加。据有关资料表明，正常人眼小梁网细胞外基质中存在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型胶原蛋白，纤维粘连蛋白和LN，透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素和硫酸角质素5种氨基多糖［2］。这些细胞外基质蛋白和降解这些蛋白相应的酶，大多数由小梁细胞合成与分泌，如果小梁细胞合成与分泌的细胞外基质蛋白增多,或降解这些细胞外基质蛋白相应的酶减少等，均可引起细胞外基质蛋白的质量与数量异常及比例失调，导致小梁网细胞外基质堆积，使房水引流阻力增加。研究显示在POAG患者的小梁网细胞外基质中，各型胶原蛋白和各种氨基多糖的含量和比例异常［3，4］。

　　二、弹性蛋白与细胞外基质堆积

　　在常规培养条件下的正常人和POAG患者的眼小梁细胞形态与功能相似，均不产生弹性蛋白［2，5］。在氟美松的诱导下，培养的正常人眼小梁细胞可产生弹性蛋白，两者呈正相关［6］。糖皮质激素引起房水引流阻力增加的机制为多方面：引起氨基多糖堆积、抑制前列腺素合成、阻止溶酶体释放蛋白酶、改变细胞骨架张力纤维或影响细胞信息传递等；但是诱导小梁细胞产生弹性蛋白，加重小梁网细胞外基质堆积，仍然是糖皮质激素性青光眼发病机制的重要因素之一。在正常人和POAG患者的小梁网细胞外基质中，用特殊检测方法可检测出弹性蛋白的含量和分布，将二者所检测出的弹性蛋白进行比较，POAG患者的弹性蛋白含量明显高于正常人［7，8］。可见无论是皮质类固醇性青光眼还是POAG，弹性蛋白均为小梁网细胞外基质堆积的重要组成成分。

　　三、TGF-β与房水引流阻力

　　TGF-β广泛存在于小梁网房水流出道中，现已发现猪眼小梁网和培养的猪眼小梁细胞均表达TGF-β1、β2和TGF-β的Ⅱ、Ⅲ型受体的mRNA，说明小梁网中存在TGF-β1、β2，小梁细胞合成和分泌TGF-β1、β2，细胞膜上存在与之相结合的受体；TGF-β可能参与了小梁网房水引流的功能活动［9-12］。有关资料表明，TGF-β使小梁细胞产生胶原蛋白、纤维粘连蛋白和LN及氨基多糖等细胞外基质蛋白增多，并抑制降解这些细胞外基质蛋白的酶合成，结果加重小梁网细胞外基质堆积，引起房水引流阻力增加。

　　四、TGF-β1与弹性蛋白

　　本研究表明,TGF-β1可诱导培养的正常人眼小梁细胞产生弹性蛋白，使小梁网细胞外基质堆积，引起房水引流阻力增加，导致POAG发生。进一步的研究将阐明TGF-β1可诱导培养的POAG患者的小梁细胞产生更多的弹性蛋白，而加重POAG的小梁网细胞外基质堆积,致房水引流阻力增高。TGF-β1诱导培养的正常人眼小梁细胞产生弹性蛋白的机制尚不清楚。本文作者已有研究表明：TGF-β1引起培养的正常人眼小梁细胞张力纤维束增多、F-肌动蛋白含量增加及β-肌动蛋白mRNA表达增强,说明TGF-β1上调微丝肌动蛋白的机制发生在转录水平。推测TGF-β1诱导培养的正常人眼小梁细胞产生弹性蛋白的机制也可能发生在转录水平。TGF-β1一方面上调小梁细胞微丝肌动蛋白,加强小梁细胞的收缩与运动、降低房水引流阻力;另一方面诱导小梁细胞产生弹性蛋白,加重小梁网细胞外基质堆积,增加房水引流阻力。TGF-β1怎样协调小梁网房水引流阻力，以维持正常的眼内压，尚有待进一步研究。
 
　　参考文献

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