Leflunomide抑制大鼠角膜移植排斥反应的免疫病理学研究
眼科 1999年第3期第8卷 实验研究
作者：郭金华 陆晓和 徐 宁 柯晓云 王 筠 陈国苍
单位：广州第一军医大学珠江医院眼科，510282
摘 要 目的：研究角膜移植排斥反应的免疫病理学变化，阐明Leflunomide的免疫抑制机理。方法：应用免疫组织化学染色方法检测环孢霉素A、Leflunomide及对照组角膜移植片中CD4＋细胞、CD8＋细胞、白细胞介素－2受体及主要组织相容性Ⅱ类抗原的表达。结果：排斥的角膜组织大量表达上述免疫细胞和分子，Leflunomide可以对这些细胞和分子产生明显的抑制作用。结论：迟发型超敏反应和细胞毒性T细胞的作用与植片的免疫性损伤密切相关，白细胞介素－2受体和主要组织相容性Ⅱ类抗原的异常表达在排斥反应中具有重要的作用，Leflunomide能抑制淋巴细胞的活化、增殖，延长角膜移植物的存活时间。
主题词 角膜移植，穿透性；移植物排斥；免疫组织化学；异恶唑类／类似物和衍生物
分类号 R779.65
Immunopathologic studies on the effects of immunosuppressant leflunom
ide on penetrating keratoplasty rejection in rats model
Guo Jinhua …∥ Ophthalmol CHN.-1999，8（3）.－168～171（Department of Ophthalm
ology，Zhujiang Hospital，First Military Medical University，Guangzhou 510282）
To study the immunopathologic process of rejection and elucidate the im
munosuppressive mechanism of leflunomide.By using immunohistochemical techniques，the expression of CD4＋ cells，CD8＋ cells，IL－2 receptor，MHC－Ⅱ antigenin rejected corneal grafts were studied.Immunohistochemical studies showed diffuse infiltration of CD4＋ cells，CD8＋ cells and strong expression of IL－2 receptor and MHC－Ⅱ antigen in rejected corneal grafts，especially in the acute rejection stage.Leflunomide can inhibit the expression of the cells and molecules in the grafts.Keratoplasty rejection is significantly related to delayed type of hypersensitivity and cytotoxic T cells，and IL－2 receptor and MHC－Ⅱ antigen also affect the rejection process；Leflunomide prolongs the survival time of corneal allografts by inhibiting Tcell activation and proliferation.
Subject terms Keratoplasty，penetrating；Graft rejection；Immunohistochemistry；Isoxazoles／analog
新型免疫抑制剂Leflunomide（LEF）是一种异恶唑类衍生物，在人体内主要代谢产物是A771726，作为一种酪氨酸激酶抑制剂能拮抗细胞因子的活性，从而抑制T细胞、B细胞和其它类型细胞的增殖，可用于移植排斥反应的预防和治疗［1］。我们在建立大鼠穿透性角膜移植术（penetrating keratoplasty，PKP）动物模型的基础上，应用免疫组织化学染色方法行角膜移植排斥的免疫病理学研究，进一步阐明LEF的免疫抑制作用，同时探讨CD4＋细胞、CD8＋细胞、白细胞介素－2受体（interleukin－2 receptor，IL－2R）、主要组织相容性Ⅱ类抗原（major histocompatibility antigen－Ⅱ，MHC－Ⅱ类抗原）在排斥反应中的应用。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 动物 取F344（RT1U）大鼠48只作为受者，Lou（RT1U）大鼠24只作为供者，供、受者均为雌性，体重200～250克，年龄2～3个月（购自华南实验动物中心）。将受体鼠随机分为四组：阴性对照组12只，CsA组12只，LEF组12只，CsA＋LEF组12只。
1.1.2 药品 LEF由美国芝加哥Rush大学医学中心Williams教授提供，CsA是SANDOZ公司产品。
1.1.3 动物处置与取材 参照Williams和Coster方法［2］，在手术显微镜下对受体鼠右眼行PKP，术中做部分改进，以粘弹剂Healon代替平衡盐液，维持前房，植片直径3.25mm，植床3.0mm，10-0尼龙丝线间断缝合8针，术后不拆线。阴性对照组，灌服芝麻油做对照；CsA组为阳性对照，CsA灌服，5mg／kg／日；LEF组，LEF灌服，5mg／kg／日；CsA＋LEF组，CsA 5mg／kg／日、LEF 5mg／kg／日灌服。上述各组均从术后第1日开始服药直至排斥反应发生。并自术后第1日起在裂隙灯下进行临床观测，排斥反应发生之前，隔日一次，排斥反应发生之后每周2～3次。以混浊、水肿和新生血管三项指标进行评分，参照Larkin等［3］的评分标准，植片混浊0～4级：0级为完全透明；1级为透明度轻度丢失；2级为透明度中度丢失，虹膜血管可见；3级为虹膜血管窥不清，但瞳孔轮廓可见；4级为瞳孔轮廓不清。植片水肿0～2级：0级为无水肿，1级为中度水肿，2级为伴有植片增厚的显著水肿。植片新生血管0～4级：0级为无新生血管，1级为新生血管在任何象限伸入达到植片半径的25％，2级为新生血管达到植片半径的50％，3级为新生血管达到植片半径的75％，4级为新生血管达到植片的中央。当植片的三个参数之和达到5或5以上时，或者植片混浊一项达到3时，即认为免疫排斥反应发生。植片透明达100天确定为长期存活。
1.2 标本制备和检查方法
1.2.1 角膜植片取材 排斥反应发生之前（术后6天）每组取3只鼠，急性排斥期每组取5只鼠，排斥反应发生后2周，每组取4只鼠。取材时剪下全部角膜组织及少许巩膜，取后立即放入O.C.T组织包埋剂，液氮速冻后－70℃冰箱中冷冻保存。采取冰冻切片法，片厚5μm，常规HE染色2张，余切片经冷丙酮固定10分钟后置入－20℃冰箱中保存待检。
1.2.2 免疫组织化学染色 免疫组织化学染色采用亲合素－生物素－过氧化物酶法（ABC法）。一抗系小鼠抗大鼠免疫球蛋白，其中W3／25为CD4＋细胞、OX8为CD8＋细胞、OX39为IL－2R、OX6为MHC－Ⅱ类抗原的单克隆抗体，购自北京帮定生物公司（进口分装）。ABC试剂盒为Vector公司产品。二抗为羊抗小鼠生物素化的IgG。阴性对照以PBS取代一抗，以大鼠脾脏作为阳性对照。显色剂为二氨基联苯胺试剂盒，购自北京中山生物有限公司。免疫组织化学染色后常规苏木素复染、脱水、透明，中性树脂封片后于光镜下观察。
1.2.3 免疫组织化学染色的结果评定 CD4＋细胞、CD8＋细胞、IL－2R和MHC－Ⅱ类抗原阳性细胞的检测，采用普通光学显微镜下随机计数植片中央区5个100倍视野中阳性细胞的数目，取其平均值。
1.2.4 实验结果的统计学处理方法 计量资料采用计算机SPSS 4.0统计软件的样本均数的两两比较——t检验。
2 结果
2.1 各组角膜移植片存活情况 对照组角膜移植片存活时间为12.375±1.768天，CsA组为17.375±1.408天，LEF组为18.250±1.356天，LEF＋CsA组为26.125±1.356天。各用药组存活时间与对照组比较显著延长，P＜0.01；联合用药组与单独用药组比较，差异显著，P＜0.01；而CsA组与LEF组相比较，差异无显著性，P＝0.0875。结果表明LEF和CsA对大鼠角膜移植的免疫排斥反应具有同效的作用，且联合用药具有协同作用，显著延长移植片的存活时间。
2.2 HE染色 角膜移植片发生排斥反应之前，切口周围出现大量的单核细胞和淋巴细胞浸润，移植片中央部可见散在炎性细胞浸润。急性排斥期间角膜移植片显著水肿、增厚，可见大量炎性细胞浸润，对照组尤甚。排斥反应发生2周后，移植片水肿减轻，浸润的细胞明显减少（图1，2，3）。
图1急性排斥期对照组角膜移植处片炎性细胞浸润(HE10×10)
2急性排斥期LEF治疗组角膜鑫植片炎性细胞浸润(HE10×10)
3急性排LEF+CSA治疗组膜移植片炎性细胞浸润(HE10×10)
2.3 免疫组织化学染色 在排斥反应发生之前，对照组角膜移植片中即已出现少量的CD4＋细胞和MHC－Ⅱ类抗原阳性细胞，而各用药组移植片却不明显。在急性排斥期，CD4＋、CD8＋、IL－2R和MHC－Ⅱ类抗原阳性细胞数大量增加（图4，5，6），以对照组明显，与CsA组、LEF组及联合用药组比较，差异有显著性（P＜0.01）；在CsA组和LEF组之间，上述免疫细胞和分子的表达无显著差异（P＞0.05）；而CsA＋LEF组与CsA组、LEF组相比较，免疫细胞和分子的表达明显减少，差异有显著性（P＜0.01），（表1）。排斥反应发生后2周时，各组免疫细胞和分子表达均较急性排斥期减少，提示排斥反应进入下调性时期。
P＜0.01各用药组与对照组相比较，差异有显著性
＃P＜0.01联合用药组与CsA组、LEF组相比较，差异有显著性
3 讨论
LEF是一种异恶唑类衍生物，在动物和人体内主要代谢产物为A771726，A771726作用于T细胞主要是抑制由基因细胞激活的T细胞的增殖，并可抑制由抗－CD3刺激或是抗－CD28 MAbs和IL－2刺激的T细胞的增殖，其作用位点位于细胞周期的G1／S阶段，类似于雷帕霉素（Rapamycin）［1］。而CsA主要是通过与T细胞表面相应的结合蛋白结合，作用于细胞内的钙和钙调蛋白依赖性的蛋白磷酸酶，从而抑制细胞活化核因子的核内转移，进而抑制转录IL－2，IL－2R的基因表达，使T细胞的增殖和免疫活性受到抑制，其作用位点位于细胞周期的G0／G1阶段。同时A771726亦被体外实验证实是酪氨酸激酶的抑制剂，由于细胞因子与其受体结合需要酪氨酸激酶的激活，酪氨酸磷酸化仍是这些受体兴奋后早期信号传导过程的重要步骤，A771726通过抑制酪氨酸激酶的活性而抑制了由IL－2结合到IL－2R和CD3交联激发的T细胞酪氨酸磷酸化，从而抑制T、B淋巴细胞的活化和增殖［4］。由于其对T、B淋巴细胞抑制的双重作用特点，免疫学家和移植医师们希望其用于各种急、慢性移植排斥反应的预防和治疗。
LEF应用于实验性角膜移植报道不多。Coupland等［5］采用挪威灰鼠对Lewis大鼠角膜移植动模型，术后给予LEF 5mg／kg／日灌服，并与阴性对照组和CsA治疗组比较，结果表明LEF和CsA同样有效地延长大鼠角膜移植物存活时间，二药联合应用具有协同作用。在对排斥反应指数（RI，混浊、水肿和新生血管三项指标）观察中，LEF能降低角膜移植片混浊、水肿的程度，但对新生血管没有明显影响。进一步研究发现LEF与抗－CD4单抗、CsA三药联合应用，显著地延长大鼠角膜移植片的存活时间，10只受体鼠有9只存活时间超过50天，而对照组移植片平均存活时间仅为12天［6］。Niederkorn等［7］采用Wistar对Lewis大鼠角膜移植动物模型，也观察到类似的结果。在本研究中，LEF和CsA同样有效地延长了角膜移植物的存活，且联合用药具有协同作用，使角膜移植物的存活时间显著延长（P＜0.01），与上述国外学者报道相似。我们在对大鼠角膜移植片进行免疫病理学研究中发现，在角膜移植排斥反应发生之前，对照组移植片中已出现少量的CD4＋T细胞和MHC－Ⅱ类抗原阳性细胞，而在LEF和CsA治疗组没有发现。在急性排斥反应期，移植片内CD4＋和CD8＋T细胞浸润增加，IL－2R和MHC－Ⅱ类抗原大量表达，尤以对照组为甚，在排斥反应发生之后二周，这些浸润的细胞和表达的分子减少。结果证实了排斥反应的发生、发展过程及剧烈程度与上述免疫细胞和分子密切相关，提示角膜移植排斥反应是多种细胞和分子共同参与的免疫反应过程，CD4＋、CD8＋T细胞的浸润和IL－2R、MHC－Ⅱ类抗原的表达是角膜移植免疫排斥病理损害的基础。在LEF和CsA治疗组中，这些细胞和分子明显低于对照组（P＜0.01），且联合用药时，这些细胞和分子显著减少（P＜0.01），可以认为LEF和CsA通过抑制这些免疫细胞的浸润和分子的表达来延缓排斥反应的发生和减轻排斥反应的程度。
图4急性排扩期对照组角膜移植CD4T细胞分布(ABC10×10)
5急性排斥期LEF治疗组角膜移植片CD4T细胞分布(ABC10×10)
6急性排斥期LEF+CSA治疗组角膜移植片CD4T细胞分布(ABC10×10)
与CsA、硫唑嘌呤相比，LEF用药安全剂量范围较大，在临床类风湿关节炎病人的治疗中，未见毒性反应，甚至在高剂量水平时也没有不良反应发生［8］。在对LEF高度敏感的狗肾移植模型中，LEF控制狗肾移植的排斥反应而无明显的毒性反应［9］。我们在对LEF实验组的观察中，未发现任何不良反应和副作用。LEF较少甚至不引起毒、副作用是其临床应用前景的又一特点。
4 参考文献
1 Chong AS－F，Gebel H，Finnegan A，et al.Leflunomide，a novel immunomodulatory agent：In vitro analyses of the mechanism of immunosuppression.Transplant Proc，1993，25：747－749.
2 Williams KA，Coster DJ.Penetrating corneal transplantation in the inbred rat. Invest Ophthalmol Vis Sci，1985，26：23－30.
3 Larkin DFP，Calder VL，Lightman SL.Identification and characterization of cell s infiltrating the graft and aqueous humour in rat corneal allograft rejection.Clin Exp Immunol，1997，107：381－391.
4 Minami Y，Takeshi K，Miyazaki T，et al.The IL－2 receptor complex：Its structure，function and target genes.Ann Rev Immunol，1993，11：245－247.
5 Coupland SE，Klebe S，Karow AC，et al.Leflunomide therapy following penetratin g keratoplasty in the rat.Grafe s Arch Clin Exp Ophthalmol，1994，232：622－27.
6 Coupland SE，Krause L，Karow AC，et al.Delay in corneal allograft rejection due to anti－CD4 antibody given alone and in combination with cyclosporin A and leflunomide.German J Ophthalmol，1995，4：294－301.
7 Niederkorn JY，Lang LS，Ross J，et al.Promotion of corneal allograft surviva l with leflunomide.Invest Ophthalmol Vis Sci，1994，35（10）：3783－3785.
8 Bartlett RR，Dimitrijevic M，Mattar T，et al.Leflunomide（HWA 486），a novel immunomodulating compound for the treatment of autoimmune disorders and reactions leading to transplantation rejection.Agents Actions，1991，32：10－26. 9 foster SE，Xiao F，Kociss K，et al.Leflunomide immunosuppression in rat small intestinal transplantation.Trans plantation，1994，58：913－916.
1998－12－04收稿
1999－02－25修回 |
