兔眼人工晶体植入术后虹膜、晶体上皮细胞纤溶酶原激活物抑制物-1mRNA的表达

　　中华眼科杂志 1999年第3期第35卷 论著

　　作者：吴强　杨冠　陈国辉　戴友林

　　单位：200233上海市第六人民医院眼科

　　关键词：虹膜；晶体；上皮细胞；纤溶酶原激活物抑制物-1

　　【摘要】　目的　观察具有合成纤溶酶原激活物抑制物-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）蛋白酶的虹膜、晶体上皮细胞在晶体摘除联合人工晶体植入术后其合成的PAI-1量的变化,以阐述PAI-1对白内障囊外摘除联合人工晶体植入术后纤维蛋白反应和后囊膜混浊形成的作用。方法　8只新西兰白兔，均1只眼经晶体囊外摘除术后在晶体囊袋内植入人工晶体,另1只眼未手术作为正常对照;每2只兔眼(2只手术眼和2只未手术眼)分别在术后第1、7、15、30天时,取出整个虹膜和晶体囊膜组织,抽取RNA;应用逆反转录-聚合酶链反应技术观测各标本中PAI-1mRNA表达量的变化,数据进行统计学分析处理。结果　在术后第1天,虹膜和晶体上皮细胞的PAI-1mRNA表达量即出现明显的升高;在虹膜组织中,PAI-1mRNA这种高水平表达可持续到术后15天(P＜0.001),但在术后30天时,其表达量又降至正常(P=0.87);而晶体上皮细胞PAI-1mRNA的表达量,在术后1、7、15、30天时术眼显著高于正常对侧眼(P＜0.001)。结论　PAI-1可能是引起白内障囊外摘除联合人工晶体植入术后纤维蛋白反应的主要原因,同时它对后囊膜混浊的发展也起到重要的作用。

　　Plasminogen activator inhibitor-1 mRNA expression by the iris and lens epithelial cells of rabbit eye with intraocular lens implantation　　WU Qiang, YANG Guan, CHEN Guohui, et al. Department of Ophthalmology, Shanghai No.6 Hospital, Shanghai 200233

　　【Abstract】　Objective　To investigate the change of plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) synthesized by the iris and the lens epithelial cells (LECs) after extracapsular cataract extraction (ECCE) with intraocular lens (IOL) implantation and the role of PAI-1 in the occurrence of fibrin reaction and the formation of posterior capsular opacification.Methods　Eight adult rabbits were studied. In each rabbit, one eye underwent ECCE with IOL implantation and the other eye was normal without any surgical intervention. The iris tissue and the lens capsule of each two normal eyes and each two surgical eyes were excised on the postoperative 1, 7, 15 and 30 days respectively. The amount of PAI-1 mRNA expresson in the specimens was detected by using reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). The data were analyzed statistically.Results　The amount of PAI-1 mRNA expresson in the iris tissue and the LECs of the surgical eyes displayed a significant increase on the first day after operation. The high expression of PAI-1 mRNA by the iris might last 15 days (P＜0.001), but it declined to the normal range on the postoperative 30 days (P=0.87). The high level of PAI-1 mRNA expresson by the LECs in the surgical eyes had significant difference when compared with that of the normal eyes at 1, 7, 15 and 30 days postoperatively (P＜0.001).Conclusion　It is indicated that PAI-1 enzyme is a major cause for fibrin reaction after ECCE with IOL implantation, and may play critical roles in the development of posterior capsular opacification.

　　【Key words】　Iris　Lens　Epithelial cells　Plasminogen activator inhibitor-1

　　纤溶酶原激活物抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)是一种广泛存在于机体内的蛋白酶，它起到特异的抑制纤溶酶原激活物(plasminogen activators,PAs)对纤溶酶原的激活。多项研究资料表明，PAI-1不但对血循环中的纤维蛋白降解起到抑制作用，而且还可对细胞外基质蛋白的降解起到保护性作用［1］。另外的研究还发现，PAI-1也是一种急性相反应的成分，在术后、外伤、心肌梗塞发生时，血循环中的PAI-1水平明显升高［2］。白内障囊外摘除联合人工晶体植入术后，术眼常不可避免地发生纤维蛋白反应。这种纤维蛋白反应的发生是否是由存在在眼房水内的PAI-1水平发生改变而导致的结果，我们应用逆反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerse chain reaction，RT-PCR)分子生物学技术，对合成PAI-1的虹膜组织、晶体上皮细胞进行研究，从PAI-1基因的转录水平揭示术后眼房水内PAI-1量的动态变化，以阐述PAI-1对眼内纤维蛋白反应所起到的重要调节作用。

　　材料和方法

　　一、主要试剂和仪器

　　1.试剂：鼠白血病病毒反转录酶(moloney murine leukemia virus reverse transcriptase,M-MLVRT)(美国Gibco Brl公司产品)，dNTP、随机引物、Tag酶、RNsin（美国Promega公司产品）。

　　2.仪器:PCR仪(PERKIN ELMER48，美国产)，计算机图像分析仪(Image Analysis System,德国产)，超速低温离心机(HERMLE ZK380，德国产)，紫外分光光度仪(Ultrospec 300，瑞典产)。

　　二、方法

　　1.实验对象及标本的制备:选用本院动物房提供的新西兰白兔8只，体重2.5～3.0kg。1只眼未进行手术作为正常对照眼,另1只眼植入人工晶体(美国Ocularvision公司产品)。方法如下：术前用1%阿托品散瞳；兔耳缘静脉注射1%戊巴比妥钠35mg/kg麻醉。用尖刀片于上方角巩缘处做10～2点钟方位的角膜缘切口,用截囊针在前囊上方做“-”字形截囊［3］，娩核，使用双管套针注吸皮质，在粘弹性物质的支撑下植入人工晶体。缝合角巩膜切口，结膜下注射庆大霉素4万U，术后每天给予复方磺胺醋酰钠眼药水、土霉素眼膏点眼治疗。每2只兔为一组，分别于术后1、3、7、15、30天时处死动物，显微镜操作下切取兔眼的虹膜和晶体囊膜组织，置入冻存管，液氮内保存以备组织RNA提取用。
 
　　2.组织标本的RNA提取：将所截取的未手术兔眼和人工晶体植入术后不同时期的兔眼虹膜和晶体囊膜，用匀浆器制成组织匀浆,然后依次加入RNA快速提取试剂和氯仿-异丙醇后，经高速离心进行标本的RNA提取;所提取的16份标本RNA，经紫外分光光度仪测定，其吸光度（A）260nm/（A）280nm比值为1.7～1.98。

　　3.组织标本mRNA的逆反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)：参照Wagner等［4］介绍的方法,并作适当修改。
 
　　引物序列：

　　PAI-1(约360bp)
　　5′ATG-GAA-TTC-CCG-TGG-AAC-AAG-AAT-GAG-ATC-AG 3′
　　3′GAG-ACA-CGG-GTA-CTA-CCG-AGT 5′
　　β-actin(828bp)
　　5′ATC-TGG-CAC-CAC-CTT-CTA-CAA-TGA-GCT-GC 3′
　　3′CGT-CTA-CAC-CTA-GTC-GTT-CGT-CCT-CAT-ACT-GC 5′

　　在20μl反应体系中加有随机引物0.2μl、RNsin1μl、待测组织细胞RNA2μg、5倍缓冲液4μl、10mmol/LdNTP1μl、M-MLVRT200IU，最后用Depc处理水补充总量，37℃下放置60min，然后升高温度至90℃下5min，再迅速下降温度;将反转录产物10μl加入包含有10倍缓冲剂液5μl、25mmol/LMgCl24μl、10mmol/LdNTP2μl、上、下引物各3μl、Tag酶0.4μl的反应体系中，用Depc处理水补充总量达50μl，石蜡油封住反应体系液面，分别按如下反应条件在PCR仪上进行cDNA的扩增。PAI-1：94℃下3min，然后94℃下15s、54℃下30s、72℃下30s，28个循环，最后在72℃下再放置10min。β-actin：94℃下3min、60℃下1min、72℃下2min1个循环后，接94℃下45s、60℃下1min、72℃下45s，循环30次，最后在72℃下再放置10min。
 
　　4.cDNA电泳：将聚合酶链反应（PCR）产物和载样缓冲液加入1%琼脂糖凝胶加样槽中电泳，电压5V/cm，电泳时间1h，然后用0.5μg/ml溴乙锭染色25min，摄片，计算机图像分析仪进行吸光度（A）扫描测定。

　　5.统计学处理方法：所测到各条带吸光度（A）值采用SAS-6.04计算机软件包进行统计分析处理。所有未手术眼和手术眼均进行F检验，术后不同时期的术眼和未手术对侧眼之间用Duncan检验进行两两比较。

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