EAU大鼠虹膜睫状体可溶性蛋白的蛋白质吸印免疫学检测研究

　　眼科 1998年第3期第8卷 实验研究

　　作者：孙旭光*　　张昌颖**

　　单位：*　　北京市眼科研究所，100005；**　北京医科大学眼生化实验室

　　关键词：虹膜；睫状体；抗原；印迹法；蛋白质

　　摘　要　目的：观察实验性自身免疫性视网膜葡萄膜炎（EAU）大鼠的虹膜睫状体中是否存在视网膜S抗原。方法：利用视网膜S抗原特异性的抗血清及免疫偶联辣根过氧化物酶，对虹膜睫状体的可溶性蛋白进行蛋白质吸印免疫学检测。结果：不论正常大鼠，还是EAU大鼠，利用本实验所采用的方法，在其虹膜睫状体中，均未发现有与S抗原特异性抗血清相互反应的可溶性蛋白成分。结论：EAU病变中虹膜睫状体炎与S抗原之间的可能关系需进一步研究。

　　分类号　R773.9

　　Study on the soluble proteins in the iris and ciliary body of EAU with western blotting／Sun xuguang…∥Ophthalmol CHN.-1998，7（3）.-180～182（Beijing institute of Ophthalmology，Beijing 100005）

　　The soluble proteins in the iris and ciliary body of the normal and EAU rats were analysed with protein immunoblotting （Western blotting）.Various samples of the proteins including the soluble protein in the iris，ciliary body and purified S-antigen were transferred from SDS-PAGE gels onto nitrocellulose sheets.Duplicated samples were treated with anti-S-antisera，then with HRP-IgG.The result showed that the purified S-antigen reacted specifically with anti-S-antisera，but no reaction with the soluble proteins in the iris and ciliary body was observed.We suggested that the relation between the acute iridocyclitis in EAU and S-antigen still need further investigation.

　　Subject terms Iris；Ciliary body；Antigen；Blotting，Western

　　利用视网膜抗原在远离眼球的部位一次性免疫，间隔2周左右，首先出现虹膜睫状体炎。随之产生视网膜葡萄膜炎。对于EAU为什么首先出现虹膜睫状体炎的表现，其原因至今尚无满意的解释。由于胚胎期虹膜睫状体中发现有S抗原的mRNA存在，使人们推测是否在病理状态下，虹膜睫状体中S抗原有非特异性表达，或者有与S抗原某些抗原决定簇相似的结构存在。本实验通过蛋白吸印免疫检测的方法对病理状态下，虹膜睫状体组织中可溶性蛋白进行研究，以求探索S抗原与EAU中虹膜睫状体炎之间可能的关系。

　　1　材料与方法

　　1.1　试剂与动物

　　完全福氏佐剂，不完全福氏佐剂购于GIBCO公司，Tween-20购自Bio-Rad公司。Tris购自BRL-GIBCO公司。十二烷基磺酸钠购自Fluka公司。丙烯酰胺，N，N’-亚甲基双丙烯酰胺购自Sigma公司。其它试剂均为国产分析纯试剂。

　　兔视网膜S抗原为本室提纯。实验动物采用Wistar纯系大鼠，EAU动物模型制作方法见参考文献［1］。

　　1.2　虹膜睫状体可溶性蛋白的蛋白吸印免疫检测

　　1.2.1　S抗原抗血清的制备

　　取兔视网膜S抗原（1mg／ml）0.1ml，加入等体积完全福氏佐剂，混合乳化成免疫原乳剂，在每只大鼠双后?底皮下各注射0.1ml免疫原乳剂（抗原量为100μg／鼠）。2周后用不完全福氏佐剂同法制备免疫原乳剂，于大鼠背部皮下多点注射0.1ml。再2周后腹腔注射抗原30μg，加强免疫一次。1周后尾静脉采血用双扩法测定抗血清效价。

　　1.2.2　双扩散法测定抗血清

　　1％琼脂，85℃水浴中使其完全融化，倾倒于直径45mm之玻璃平皿中，室温下凝固，方阵型打孔，将抗血清加入中心孔最高稀释度为1∶16，周围四孔分别加入1mg／ml　S抗原，大鼠晶体蛋白抗原，大鼠角膜蛋白抗原及0.9％氯化钠（对照）。置37℃下反应24小时后，观察结果。沉淀带出现后，将凝胶用0.9％氯化钠溶液浸泡24小时。考马斯亮蓝染色，10％醋酸溶液脱色，照像记录结果。

　　1.2.3　虹膜睫状体可溶性蛋白制备

　　S抗原免疫后第14天，断颈处死大鼠，冰浴下剪取虹膜睫状体组织，用50mmol／L磷酸缓冲液（pH7.4）制成10％匀浆，离心10　000转／分，4℃，15分钟，取上清备用。

　　1.2.4　SDS－PAGE电泳

　　制备12％的SDS平板凝胶，将正常及病变大鼠的虹膜睫状体可溶性蛋白，视网膜S抗原和标准分子量蛋白分别上样，上样量为20μg，常规SDS－PAGE电泳，泳毕，细心将凝胶与平板玻璃完整分离，用蒸馏水洗净凝胶表面的电泳液，用于蛋白质吸印，方法详见参考文献［2，3］。

　　1.2.5　蛋白质吸印免疫检测

　　用经电转移液（含39mmol／L甘氨酸，48mmol／L tris，0.037％SDS及20％甲醇）浸泡过的硝酸纤维膜置于凝胶表面，置于垂直电转移槽中，进行转膜。条件：电压：70伏，电流：500mA，泳时：1.5小时。仪器：LKB2005　Tran　-sphor垂直电转器，之后用三蒸水洗膜，室温干燥30分钟。置于0.2％丽春红S染液中（0.2％丽春红S，3％三氯乙酸，3％磺基水杨酸），蛋白显色后三蒸水漂洗。

　　将转移后的硝膜置于2％牛血清白蛋白（50mmol／L）磷酸缓冲液（pH7.4）中室温封闭60分钟，取出后，移入含适量抗S抗原抗血清的封闭液中，10℃，温育2小时。取出用磷酸缓冲液洗膜。硝膜置于TBST液中（含50mmol／L　Tris-HCl，pH7.4，200mmol／L氯化钠及0.05％　Tween-20），洗膜10分钟，移入含1％牛血清白蛋白的TBS中（含50mmol／L　Tris-HCl，pH7.4，200mmol／L氯化钠），并加入免疫偶联的辣根过氧化物酶（HRP－IgG），稀释度为1∶200。室温温育1小时，之后取出TBS洗涤，置于0.06％二氨基联苯胺染液中，（含0.06％二氨基联苯胺，0.03％氯化钴，0.03％过氧化氢），染色2～5分钟，取出后用磷酸缓冲液漂洗，立即照像记录。

　　2　结果

　　双扩散法对S抗原抗血清的测定：结果见图1。从图中可以看出，只有S抗原与其抗血清对应的孔间有沉淀线出现，其余对应孔间均无沉淀线。实验结果表明，用S抗原制备的抗血清有很好的特异性。

　　虹膜睫状体可溶性蛋白的蛋白吸印免疫检测；结果见图2。从图中可以看出，只有提纯的S抗原能够与其抗血清特异性反应，并在硝膜上显示蛋白染色带（2-A1），而EAU大鼠及正常大鼠虹膜睫状体可溶性蛋白则无反应，硝膜上未见蛋白染色带（2-A2、3）。我们实验结果表明，无论在正常大鼠，还是在EAU大鼠虹膜睫状体中，利用蛋白质吸印免疫学检测法均未见到可与S抗原抗血清特异性反应的可溶性蛋白存在。

　　3　讨论

　　利用原位杂交技术对胚胎眼进行研究发现，人S抗原的mRNA在胚胎13周时便出现，大鼠S抗原的mRNA在胚胎第十五天出现。人及大鼠S抗原蛋白质本身则分别在胚胎22周及出生时出现［4］。除了视网膜组织外，在人胚胎眼的虹膜组织中及鼠胚胎眼的虹膜睫状体组织中，均发现有S抗原的mRNA，这种现象一直持续到出生，出生之后S抗原的mRNA只存在于视网膜［5］。

　　我们的实验结果表明，正常大鼠的虹膜睫状体组织中，利用蛋白质吸印免疫学检测法未能发现S抗原存在。在EAU大鼠免疫后第14天，为其虹膜睫状体炎较为显著的阶段，此时的虹膜睫状体组织中也未发现有S抗原存在，因此我们认为，由S抗原所诱发的EAU病变中，虹膜睫状体炎的发生与S抗原之间的可能关系需要进一步研究。

　　近年国外的研究发现，利用免疫组化及原位杂交技术对10名非葡萄膜炎患者的虹膜组织进行观察，均未发现有S抗原及其mRNA存在。但对29名葡萄膜炎患者的32份虹膜切除的组织标本观察，发现1份标本中有S抗原存在。12名患者的虹膜组织中发现有S抗原的mRNA，而且其中大部分患者（10／12）应用类固醇激素达三年以上。由此推测这些病程迁延的患者虹膜组织中有S抗原的mRNA或S抗原存在，可能是局部免疫调节因素及皮质类固醇激素治疗所致［6］。

　　综上所述，我们认为，由于自身免疫性视网膜葡萄膜炎的病理改变可能涉及到多种因素，而且在不同的病变时期各种因素的作用可能会起变化，所以在研究S抗原与EAU的虹膜睫状体炎之关系时，除了利用蛋白质检测方法以外，还应考虑采用更为敏感的分子生物学方法检测S抗原的mRNA的存在，而且有必要对病变的不同时期的组织进行研究。

　　图1　琼脂平板免疫双中央孔：S-抗原抗血清　1：S-抗原　2：大鼠晶体可溶性蛋白　3：大鼠角膜可溶性蛋白　4：生理盐水对照图2　SDS-PAGE电泳及免疫蛋白吸印　2-A　1：S-抗原　2：EAU虹膜睫状体可溶性蛋白　3：正常大鼠虹膜睫状体可溶性蛋白　2-B　1:正常大鼠虹膜睫状体可溶性蛋白　2：EAU虹膜睫状体可溶性蛋白　3：S-抗原　4：蛋白分子量标准

　　4　参考文献

　　1　孙旭光，张昌颖.兔视网膜S抗原的提纯与分析.中华眼科杂志，1996；32（1）：45

　　2　金冬雁等.分子克隆试验指南.第二版，北京：北京科学出版社，1992：888

　　3　金冬雁等.分子克隆试验指南.第二版，北京：北京科学出版社，1992：880

　　4　Ming Ni，Kunihiko，Yamak，et al.Development expression of S-antigen in factal human and rat eye.

　　curr Eye Res，1992；11（3）：219

　　5　Faure JP，Mirshahi M.Curr Eye Res，9（supp1）：163

　　6　Chan CC，LI-Q，et al．Enhancement of S-antigen and its mRNA in the irides of uveitis patients。J Autoimmune，1992；5（6）：719

（1997-03-25收稿，1998-03-18修回）