微量分光光度法检测光损伤状况下大鼠视网膜视紫红质含量的变化△

　　眼科 1999年第4期第8卷 临床研究

　　作者：刘瑜玲　严密　张强　刘柏林

　　单位：刘瑜玲 北京市眼科研究所，100730，现在北京医科大学第三临床医院眼科严密 华西医科大学第一临床医学院眼科；张强 北京医科大学药学院；刘柏林 华西医科大学基础医学院分子生物学研究室

　　关键词：视紫质；视网膜／损伤；分光光度法；动物；实验

　　摘　要　目的：探索视紫红质在鼠视网膜光化学损伤中的变化规律。方法：用微量可见紫外分光光度仪分别测定接受连续光照1、2、3、4天后以及光照1和3天，置暗环境恢复2、7、14天后大鼠视网膜视紫红质含量的变化。结果：连续光照致视紫红质含量在光照开始的1～2天内急骤下降，以后趋于平缓。在一定范围内延长光照时间可使视紫红质含量水平更为低下。光照后暗环境中其含量的恢复并非呈直线上升，在1周左右表现为一个回落。结论：连续光照可使大鼠视网膜视紫红质含量显著减少；光照时间在一定范围内与含量水平密切相关。微量分光光度法为一种检测视网膜视紫红质含量的简便和快速的方法。

　　分类号　R779．12

　　The changes of rhodopsin levels in light-damaged rat monitored by spectrophotometery

　　Liu Yuling…

　　Ophthalmol CHN．-1999，8（4）．-230～232（Dept．of Beijing Institute of Ophthalmology，Beijing 100730）

　　In order to understand the rule of the change of the rhodopsin levels in the retinas of light-damaged rat，the rhodopsin levels in the rat retinas after 1，2，3 and 4 day continuous light exposure，as well as the rhodopsin levels after 2，7 and 14 day recovery in the dark following 1 or 3 days continuous light exposure were spectrophotometrically analyzed．Following the continuous light exposure，the rhodopsin levels in rat retinas dropped dramatically within the frist 1 or 2 days，then changed slowly．In certain period of time，the longer light exposure was received，the lower rhodopsin levels in rat retinas were recoreded．As the time of recovery in dark increased，the rhodopsin levels gradually increased，and followed a drop in about one week，then continued to increase．The rhodopsin levels in rat retinas greatly decreased after continuous exposure to light，and the time of light exposure closely correlated with the rhodopsin levels in certain periode of time．It is a good way to analyze the rhodopsin levels in rat retinas simply by spectrophotometery．

　　Subject terms Rhodopsin； Retina／inj Spectrophotometery； Animals，laboratory

　　研究表明：视紫红质在视网膜光化学损伤中起着重要作用，而且视紫红质水平的变化与光化学损伤的程度或易感性密切相关。我们通过建立大鼠的视网膜光化学损伤模型，应用微量可见紫外分光光度仪动态观察接受连续光照及光照后暗环境中恢复时间不等的大鼠视网膜视紫红质含量水平的变化。目前国内尚未见测定视网膜视紫红质的研究报道。

　　1　材料与方法

　　1．1　实验动物、试剂与仪器

　　Wistar大鼠，体重160±10克（华西医大实验动物中心提供）；Triton　X－100（上海化学试剂采购供应站进口分装）；其余试剂均为国产分析纯。超声震荡器（Transsonic　470／H，ε／ma　Germany）；低温高速离心机（J2-21型Beckman　USA）；ST-血型光度计（北京师范大学光电仪器厂）；微量可见紫外分光光度仪（M750 UVIS￣A型?国营东方仪器厂）。

　　1．2　光化学损伤的动物模型

　　六面均安装有绿色荧光灯的自制光照箱（波长480～560nm，常州市荧光灯厂），箱内中心各向照度为1　000?Lx，平均照度1　100±106.9?Lx。光照箱各面板上钻有99个直径为0.7cm的通气孔。实验大鼠在循环光条件下饲养10天，然后在暗房内适应24小时后，开始接受光照，光照过程不散瞳，不麻醉，不限活动和进食等，光照后送回暗房饲养。

　　1．3　视紫红质含量的测定

　　光照后的大鼠在不同时间于暗室中红灯下用乙醚处死，取出右眼球，沿角膜缘剪除角膜，娩出晶体及玻璃体，沿赤道部将眼球切成前后两半，置于0.5ml的Eppendorf管内，用磷酸盐缓冲液（0.1mol／L，pH　7．0）短暂洗涤后，加入含有15%　Triton　X－100的磷酸缓冲液0.4ml，于超声震荡器在冰浴中超声粉碎15分钟，取出于低温高速离心机上离心（4℃，1　500rpm，15分钟），吸取上清液，在微量紫外可见分光光度仪上于500nm处测定吸收度A1，然后将同一上清液在100W白炽灯下照射10分钟后再测吸收度A2，视紫红质含量按吸收度A＝A1－A2计算，按视紫红质的克分子吸收系数（E＝4．0×104／mol／cm）［1］将其以每只眼的nmol数表示。

　　1．4　统计学处理

　　采用方差分析Q检验及T检验分别分析光照前后、不同光照时间或光照持续过程中不同时间点的视紫红质含量水平。

　　2　结果

　　2．1　光照时间与视紫红质含量的变化

　　取Wistar大鼠30只，随机分成6组，每组5只。按前述动物模型光照不同时间，然后依法测定其视紫红质的含量。光照前每只眼的视紫红质含量为2.25±0.14nmol，光照12小时后，视紫红质含量就下降了50%，光照1天后下降了约70%，光照2天下降约90%，以后则变化不大，即随着光照时间的延长，大鼠视网膜中视紫红质的含量在开始的1～2天内急剧下降(P＜0.01），以后则趋于平缓，差异无显著性（P＞0.05）（表1）。

　　表1　光照时间与视紫红质含量（±s）的变化

　　*与未光照组比较P＜0.01

　　△与连续光照0.5d组比较，P＜0.01

　　＋与连续光照1d组比较，P＜0.01

　　▲与连续光照2d组比较，P＜0.01

　　各时间点样本量n＝5

　　2．2　光照后的恢复期与视紫红质含量的变化

　　取Wistar大鼠45只，随机分成9组，每组5只；其中4组接受1天的光照，另4组接受3天光照，1组不接受光照作为对照。然后在黑暗中恢复一定时间后测定眼中视紫红质的含量，结果分别见表2-A及表2-B。可见接受不同的光照时间的两组大鼠在光照后，其视网膜中视紫红质的含量水平均较光照前显著下降（P＜0.01），之后则逐渐恢复，但随着恢复时间的延长，并非呈直线回升，在7天左右有一个回落，以后又逐渐回升，可直至光照后14天，无论光照1天还是3天组的大鼠，视紫红质含量均未能恢复到光照前的水平，前者可回升到光照前水平的50%左右，后者只能回升到原有的35%左右。

　　此外，通过比较不同光照时间的大鼠视网膜视紫红质含量在光照后的变化，我们还发现，光照1天组的大鼠比光照3天组的大鼠视网膜视紫红质下降要少，而光照3天的大鼠视紫红质损失较多，14天后视紫红质回升到较低的水平。两组之间在相应各时间点比较，除14天（P＜0.05）外，其余差异均有高度显著性（P＜0.01）（表2－C）。

　　表2－A　光照后的恢复期与视紫红质

　　*与未光照组比较，P＜0.01

　　△与恢复14天组比较，P＜0.01

　　＋与恢复7天组比较，P＜0.01

　　▲与恢复2天组比较，P＜0.01

　　各时间点样本量n＝5

　　表2－B　光照后的恢复期与视紫红质

　　*与未光照组比较，P＜0.01

　　△与恢复14天组比较，P＜0.01

　　＋与恢复7天组比较，P＜0.01

　　▲与恢复2天组比较，P＜0.01

　　各时间点样本量n＝5

　　表2－C　光照后的恢复期与视紫红质

　　3　讨论

　　本实验通过随机对照，采用高度灵敏、快速简捷的分光光度法，检测到光照所致视网膜中视紫红质含量下降的变化规律，进一步证明可见光及其所激发的致伤因素，可迅速通过抑制视紫红质再生［2］或／和视蛋白的合成，使视网膜中视紫红质含量下降，从而达到对视网膜组织和细胞的损伤效应。

　　通过比较光照不同时间的恢复期中的视紫红质含量水平，说明视网膜视紫红质含量水平不仅取决于光照的强度，而且取决于光照的持续时间，在一定的时间范围内，光照持续时间长者，视紫红质含量相应更为低下。而损伤后含量的恢复，则是从各自的起点，以较为缓慢的速率增长。同时，我们还观察到，无论光照时间长短，随着恢复时间的延长，视紫红质含量并非呈直线地回升，而是在7天左右有一个回落，以后又继续回升。这一结果与国外一些相应的研究结果相符［3，4］。据认为，在光性视网膜损伤后一周左右，视紫红质含量水平的上升之所以表现为一个回落，是因为此时巨噬细胞进入视网膜组织中，开始吞噬损伤后的盘膜碎片；同时，这一过程可激活巨噬细胞质膜中的NAD（P）H氧化酶，产生大量的超氧化物自由基，使含有很多不饱和脂肪酸的生物膜发生脂质过氧化反应形成脂质过氧化物，导致视网膜组织细胞的破坏，从而引起视网膜中视紫红质合成的再次下降。

　　△本课题受国家自然科学基金资助

　　4　参考文献

　　1 Fulton AB，Manning KA，Baker BN，et al．Dark-adapted sensitivity，rhodopsin content，and background adaptation in pcd／pcd mice．Invest Ophthalmol Vis Sci，1982，22：386．

　　2 Penn JS，Baker BN，Howand AG，et al．Retinal light damage in albino rats：lysosomal enzymes rhodopsin，and age．Exp Eye Res，1985，41：275．

　　3 Lam S，Tso MOM，Gurne DH．Amelioration of retinal photic injury in albino rat by Dimethylthiourea．Arch．Ophthalmol，1990，108：1751．

　　4 Rosner M，Lam TT，Fu J，et al．Methylprednisolone ameliorates retinal photic injury in rats．Arch Ophthalmol，1992，110：857．

　　（1998-01-08收稿）