氧自由基诱导培养的牛视网膜色素上皮细胞凋亡的研究

　　中华眼底病杂志 1999年第2期第15卷 论著摘要

　　作者：鹿庆　孙葆忱　王津津

　　单位：100730　北京市眼科研究所（鹿庆、孙葆忱）；北京同仁医院中心实验室（王津津）

　　关键词： 色素上皮，眼；眼损伤；细胞死亡；疾病模型，动物；细胞，培养的；聚合酶链反应；基因表达

　　中国图书资料分类法分类号　R339．144　　R773　　R446

　　为进一步从细胞和分子水平研究视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞氧化损害的机制，为临床防治与RPE细胞相关眼病提供理论依据，我们对氧化损伤的牛RPE细胞是否存在着凋亡以及p53基因表达水平的变化等进行了研究。

　　1　材料与方法

　　1．1　主要试剂　牛眼球购买于北京市清真食品厂，改良Eagle培养液（Delbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM）（GibcoBRL公司），胎牛血清（天津血液研究所），鼠抗人p53单克隆抗体（北京天象人公司），辛基酚聚乙二醇醚（Triton）（Sigma公司），Tris（Serva公司），p53　cDNA探针（北京医科大学人民医院提供），聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒（北京原平生物技术公司）p53上游引物：5′-TTCCTCTTCCTGCAGTACT-3′（第5外显子），下游引物：5′-CAAGTGGCTCCTGACCTGGA-3′（第6外显子）。

　　1．2　主要方法　①牛RPE细胞培养的方法与鉴定：参见Kelley的方法［1］。②RPE细胞氧化损伤模型制作：参考Augustin［2］的方法选择次黄嘌呤（hypoxanthine，HX）0．1　mmol／L，黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）5 U／L作为所有氧化损伤实验中HX／XO的标准浓度。③原位末端标记（TdT-mediated biotin-dUTP nick-end labeling，TUNEL）技术测定细胞凋亡：将传代牛RPE细胞用胰酶消化后，漂洗、离心，固定在载玻片上。加入末端脱氧核苷酸转移酶反应液，37℃，1小时，漂洗两遍。加入链抗生物素蛋白-碱性磷酸酶（streptavidin-alkaline phosphatase，SA-AP）反应液，37℃，温育30分钟。硝基蓝四氮唑和5溴1氯3吲哚磷酸钠混匀后加在载玻片上，37℃温育30分钟。Tris液（pH7．5）、乙二胺四乙酸终止反应，显微镜下观察结果并照相。阳性凋亡细胞表现为细胞核有蓝紫色着色，显微镜下记数5个中倍镜视野中的阳性细胞总数，进行四格表资料的χ2检验。④免疫组织化学法测定p53蛋白表达：将传代RPE细胞用无水乙醇固定10分钟，Tris液（pH7．6）冲洗两遍，晾干。滴加一抗，4℃过夜，Tris液冲洗，37℃二抗孵育60分钟，Tris液冲洗，辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素孵育60分钟，Tris液冲洗，3，3-二氨基联苯胺显色，苏木素复染，脱水，甘油封片，　在中倍镜下观察。p53蛋白表达阳性表现为细胞核呈棕黄色着色，否则为阴性。⑤原位杂交法测定p53　mRNA表达：将传代的细胞用胰酶消化后，离心，弃上清液，涂片，37℃烘干，2％多聚甲醛与2％戊二醛固定，平衡盐溶液漂洗两次，加入蛋白酶K，37℃10分钟，2％多聚甲醛与2％戊二醛再固定1分钟，平衡盐溶液洗两次，70％乙醇，90％乙醇，无水乙醇各5分钟。0．2　ng／μl的标记探针和20％硫酸葡聚糖甲酰胶溶液涂在玻片上，100℃烘烤5～8分钟，0℃，氧钒核苷复合物混匀涂在玻片上加盖玻片，40～42℃湿盒过夜，缓冲液冲洗，阻断液室温15分钟，SA和AP37℃，30～40分钟，底物缓冲液洗三次，硝基蓝四氮唑和5溴1氯3吲哚磷酸钠滴片，37℃，置于湿盒1．5～2．0小时，0．5％核固红复染，双重蒸馏水冲洗，晾干，观察。细胞浆内出现蓝紫色颗粒或絮状物者为阳性，否则为阴性。为能定量观察RPE细胞p53蛋白和mRNA表达的情况，分别在显微镜下数6个中倍镜视野中的阳性细胞数，进行四格表资料的χ2检验。⑥逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT，PCR）分析：取培养瓶中的RPE细胞约4×106，利用异硫氰酸胍法提取总RNA［3］，按PCR试剂盒说明进行PCR扩增。按下述条件扩增35个循环，94℃变性45秒、55℃退火45秒、72℃延伸45秒，35个循环后，72℃后延伸60秒。PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，溴乙锭染色后在长波紫外线下观察并照相，有300碱基对（bp）带者为p53　mRNA表达阳性。

　　2　结果

　　2．1　原位末端标记技术测定细胞凋亡　在原位末端标记的牛RPE细胞涂片上，可见细胞核中有蓝紫色的颗粒状沉淀，形态不一，有的核全染，有的染成半月形，有的成环状。正常对照组与HX／XO组阳性细胞数分别为10、150，二者比较差异有显著性（P＜0．01）。

　　2．2　测定p53蛋白和mRNA表达结果　免疫组织化学染色后，在正常对照组中，未发现p53蛋白呈阳性的细胞，在HX／XO组中，p53蛋白阳性的细胞数为154。在进行原位杂交的RPE细胞涂片上，HX／XO组中p53　mRNA表达阳性的细胞数为143，而在正常对照组中，p53　mRNA表达阳性的细胞数为22。HX／XO组与正常对照组表达p53蛋白和p53　mRNA阳性细胞数相比较，差异有显著性（P＜0．01）。

　　2．3　RT-PCR法测定P53　mRNA表达的结果　为了进一步证明p53表达水平的变化，利用PCR技术对p53　mRNA表达进行了定量测定，HX／XO组RPE细胞p53　mRNA表达的辉度值为2．338，高于正常对照组p53　mRNA的水平（辉度值1．239）。

　　3　讨论

　　3．1　RPE细胞凋亡与氧化损伤　HX／XO反应是生物体自身的一种反应，产生主要以氧自由基为主的各种活性氧，所以选择该系统作为氧化剂，产生氧化损伤的模型是有代表性的。研究表明［4］，诱导凋亡的因子很多是氧化剂或细胞氧化代谢的刺激剂。为了进一步证实牛RPE细胞在氧化损伤后早期存在凋亡，我们选择了原位末端标记技术，该项技术与DNA凝胶电泳相比，在凋亡早期研究中，对DNA断裂的检测比较敏感。我们发现牛RPE细胞核有DNA的断裂的存在，从而证实氧化损伤确实可造成RPE细胞的凋亡。

　　3．2　p53基因与氧化损伤　p53基因被称为凋亡基因，野生型p53蛋白是一种细胞生长的负调控因子，它通过反式激活WAF1／CIP1基因的转录，抑制CDK（cyclin-depedent　kinase）激酶激活，阻断细胞周期或直接抑制c-fos，c-jun等基因的转录［5］，抑制多种细胞的生长。DNA损伤引起的细胞凋亡过程中，野生型p53基因是必需成分［6］。p53蛋白诱发RPE细胞凋亡可提供一防护机制，使受损细胞不能存活。本研究发现，氧化损伤可导致RPE细胞p53蛋白和mRNA表达增强。由于mRNA不同于蛋白质，其主要存在于细胞浆中，蛋白质则是由mRNA翻译而来，因此，在正常对照组中，虽有少量p53mRNA，但因野生型的p53蛋白半衰期短，并不一定在细胞核上观察到p53蛋白的表达。

　　本研究显示氧自由基可造成培养的牛RPE细胞中凋亡细胞增加，并进一步证实了p53基因可能促进细胞凋亡的作用，为今后防治与RPE相关眼病提供了一定的理论依据。

　　本课题受北京市自然科学基金资助，基金号　7962007

　　4　参考文献

　　[1]　kelley WM，Turer JK，Reh TA．Regulation of proliferation and photoreceptor differentiation in fetal human retinal cell cultures．Invest Ophthalmol Vis Sci，1995，36：1280-1289．

　　[2]　Augustin AJ，Hunt S，Breipohl W，et al．Influence of oxygen free radicals and free radical scavengers on the growth behaviour and oxidative tissue damage of bovine retinal pigment epithelium cells in vitro．Graefe′s Arch Clin Exp Ophthalmol，1996，234：58-63．

　　[3]　姜泊，张亚历，周殿元．分子生物学常用实验方法．第二版．北京：人民军医出版社，1997．57-58．

　　[4]　Thomas MB，Paul AS．Oxidative stress as a mediator of apoptosis．Immunology Today，1994，15：7-10．

　　[5]　EI-Deiry WS，Harper JW，Oconnor PM，et al．WAF1／CIP1 is induced in p53-mediated G1 arrest and apoptosis．Cancer Res，1994，54：1169-1174．

　　[6]　Lowe SW，Schmitt EM，Smith SW，et al．p53 is required for radiation-induced apoptosis in mouse thymocytes．Nature，1993，362：847-849．