用原位杂交法检测单纯疱疹病毒Ⅰ型在潜伏感染时的少量潜伏相关转录本表达
眼科研究 2000年第4期第18卷 实验研究
作者：刘卫华 王香兰 桑建利 张勇
单位：刘卫华 王香兰（100005北京市眼科研究所）；桑建利（北京师范大学生物系）；张勇（北京同仁医院病理科）
关键词：单纯疱疹病毒；潜伏感染；原位杂交
摘要 目的探讨单纯疱疹病毒Ⅰ型在三叉神经节内潜伏感染时的基因表达。方法以BALB／c小鼠制备单纯疱疹性角膜炎，种毒后36天取三叉神经节和角膜，用免疫组化法检测病毒的抗原表达。制备cRNA探针，用原位杂交法检测m-LAT的表达。结果种毒后36天，免疫组化结果为阴性，原位杂交结果为阳性。结论HSV-1在三叉神经节内潜伏感染时基因的转录并未静止，有m-LAT基因的表达。
分类号 R772
Detection of herpes simplex virus type Ⅰ minor latency-associated transcript
during latent infection in trigminal ganglia by in situ hybridization
Liu Weihua Wang Xianglan Sang Jianli et al．
（Beijing Institute of Ophthalmology，Beijing 100005）
Abstract ObjectiveTo detect the HSV-1 RNA expression in latent infection in trigminal ganglia．MethodsHSV-1 KOS strain was inoculated on BALB／c mice to make the model of murine herpes simplex keratitis（HSK）．36 d after inoculation，trigeminal ganglia and cornea were removed to detect the HSV-1 gC antigen expression by immuno-histochemistry．The digoxigenin-labelled RNA probe was used，m-LAT was detected by in situ RNA hybridization．Results36 d after inoculation，no positive signals was detected by immuno-histochemisty，and positive signals with antisence probe were detected by in situ hybridization．ConclusionHSV-1 RNA expression was not completely quiet during latent infection，and the m-LAT was positive.
Key words herpes simplex virus latent infection in situ hybridization
单纯疱疹病毒（herpes simplex virus HSV） 在动物中可建立急性感染和潜伏感染。HSV为双股DNA病毒，在产毒感染时有70多个基因表达。在潜伏感染时末梢神经细胞中只有1个区域的病毒基因组有转录，称为潜伏相关转录本，（latency-associated transcripts缩写为LATs），LATs共有4种其中之一为8.5-kbLAT［1］。
本实验以BALB／c小鼠制备单纯疱疹性角膜炎，小鼠既易建立潜伏感染病毒又不易自然复发，是研究HSK复发的理想模型［2］。急性感染和潜伏感染时取三叉神经节和角膜，用免疫组化法检测病毒的抗原表达。制备cRNA探针，用地高辛标记，原位杂交法检测m-LAT，m-LAT部分代表8.5-kbLAT的表达。
1 材料和方法
1.1 材料
单纯疱疹病毒Ⅰ型KOS株，TCD50＝10－5.5。
动物采用BALB／c雌性小鼠，4～6周，购自中国医学科学院实验动物研究所繁育场。
检查仪器：Topcon SL-6E裂隙灯显微镜
试剂 单克隆抗体：抗HSV-1糖蛋白gC的Mad-2为Dako公司产品；生物素—抗兔免疫球蛋白为Dako公司产品；ABC试剂盒为Vector公司产品。
1．2 方法
1．2．1 动物接种 种毒组共16只BALB／c小鼠，噻胺酮麻醉后，角膜上皮划痕，每眼滴入病毒原液10μl。随机抽样分成2组，每组8只小鼠。第1组为感染组，第2组接种病毒后4天取材。设立模拟感染组，8只小鼠，角膜划痕后不接种病毒。裂隙灯显微镜观察角膜病变，记录死亡情况。
1．2．2 标本制备 10％甲醛（pH7.4）固定2h，常规脱水、浸蜡、包埋。
1．2．3 病毒抗原免疫组织化学检测 石蜡切片为4μm。一抗（兔抗人HSV-1糖蛋白单克隆抗体），在4℃过夜，二抗（生物素标记的羊抗兔IgG抗体）37℃孵育1h，三抗（ABC复合物）在37℃孵育1h,用DAB显色，苏木精复染。用PBS代替一抗做阴性对照。
1．2．4 原位杂交探针制备 质粒pMlu-Bam由JOHN MAGGIONCALDA教授惠赠（Jefferson Cancer Institute of Jefferson Medical College），利用S／P连接处（Junction：short／long接头）插入PGEM4Z中，是氨苄青霉素抗药性，用于探测8.5kb LAT，pMlu-Bam（HSV-1 nt121640—123430）［3］pMlu-Bam质粒分子量约6.0kb。反义探针为HindIII内切酶线性化后，用SP6RNA聚合酶体外转录合成，正义探针为用EolI内切酶线性化后，用T7RNA聚合酶体外转录合成。RNA探针用地高辛标记。探针碱水解为300bp。
1．2．5 原位杂交 设立2组阴性对照，一组为加入正义探针，一组为模拟感染的三叉神经节标本。
石蜡标本常规脱蜡入水，滴加蛋白酶K，0.4％的甲醛溶液中4℃处理10min，过水后浸入0.25％（V／V）的乙酸苷溶液（含0.1mol／L三乙醇胺）中处理10min。4×SSC中5min，42℃预杂交2h。加杂交液55μl（含2μl地高辛标记的探针）42℃杂交20h。在4×SSC、2×SSC、2×SSC中各洗片5min，放入0.1×SSC中洗片10min，浸入缓冲液1中5min,加200μl封闭液温育20min，加50μl抗体溶液（1∶ 500）温育30min,加100μl显色剂（NBT66.7μl，BCIP35μl）37℃温育显色至适当为止，浸水终止反应。
2 结果
2．1 动物实验结果
接种HSV-1后2～4天，种毒组小鼠角膜均发病，出现点状、棒状、树枝状角膜炎，种毒后36天，无树枝状和地图状角膜炎。接种病毒后第6～12天因单纯疱疹性脑炎共死亡3只。
2．2 免疫组化结果
种毒后4天取材的角膜上皮见大量深棕色颗粒，胞核内也有少许颗粒。模拟感染组均无染色。种毒后36天，角膜和三叉神经节的胞浆和核内均无染色。
2．3 原位杂交结果
急性感染（种毒4天后取材）期，用反义探针检测到病毒的转录，模拟感染小鼠三叉神经节，检测结果为阴性（图1）。在潜伏感染时（种毒后36天），用正义探针未检测到病毒转录，用反义探针检测到病毒的转录，见蓝紫色颗粒主要位于三叉神经节的细胞核内，10个三叉神经节内m-LAT表达均为阳性（图2）。
3 讨论
HSV-1原发感染后，通过快速轴索转运于感染后2～10天到达三叉神经节后，在神经元细胞中建立潜伏感染，或者复制后可进入非神经元细胞［4］。在潜伏感染状态，病毒的完整基因组位于感染细胞核内，没有病毒复制，也不发病［5］。
LATs是一个转录家族，LATs是在HSV-1基因组的独特长片段（UL片段）反转重复序列ICPO的互补链上转录，与ICPO的转录方向相反［1］。潜伏感染的神经元有1.45-kb LAT转录增多，被认为是来自2.0-kb LAT的拼接产物。2.0-kb LAT来自8.5-kb前体，是内含子［6，7］，8.5-kb转录的5′末端位于核苷酸118801，在127167可能有一个多聚腺苷酸化的信号［7］。另外，用原位杂交发现在潜伏感染的神经元中也有2.0-kb LAT上游和下游转录的增加［3］。下游杂交信号称为m-LAT，部分代表8.5-kb的转录［7］。又有研究表明m-LAT与LATs转录方向一致，与ICPO的mRNA转录方向相反，可能与LAT有关，是LAT的前体，也可能是LAT的一种产物［3］。
图1 模拟感染三叉神经节中m-LAT表达阴性（132×）
Fig.1 positive signals were detected from latent infected trigeminal ganglia hybridized with RNA probe （pMlu-Bam）
图2 潜伏感染三叉神经节中m-LAT表达阳性（132×）
Fig.2 No positive signals were detected from mock infected trigeminal ganglia with antisence probe（pMul-Bam）．
本实验在种毒后4天，角膜和三叉神经节病毒抗原表达为阳性，以胞浆中表达为主，细胞核中有少量表达。证明HSV-1病毒可在角膜上皮层大量复制并在较短的时间内到达三叉神经节造成急性感染。
当角膜病变好转，在种毒后36天取材，角膜和三叉神经节中抗原表达均为阴性，没有病毒复制，HSV-1处于潜伏感染状态，三叉神经节有m-LAT表达，见蓝色的颗粒位于三叉神经节内。
参考文献
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2，Laycock KA，Lee SF，Brady RH，et al．Characterization of a murine model of recurrent herpes simplex viral keratitis induced by ultraviolet B radiation Invest Ophthalmol Vis Sci，1991，32∶ 2741
3，Mitchell WJ，Lirette RP，Fraser NW，et al．Mapping of low abundance latency associated RNA in the trigeminal ganglia of mice latently infected with herpes simplex virus type 1．J．Gen．Virol，1990，71∶ 125
4，Valyi-Nagy T，Deshmane S，Dilliner A，et al．Induction of cellular transcription factors in trigeminal ganglia of mice by corneal scarification，herpes simplex virus type 1 infection，and explantation of trigeminal ganglia．Journal of Virology，1991，Aug∶ 4142
5，Abghari SZ，Stulting RD，Petrash JM．Detection of herpes simplex virus type 1 latency-associated transcripts in corneal cells of inbred mice by in situ hybridization．Cornea，1992，11（5）∶ 433
6，Devi-Rao GB，Goodart SA，Hecht LM，et al．Relationship between polyadenylated and nonpolyadenylated herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript．J Virol，1991，65∶ 2179
7，Maggioncalda J，Mehta A，Fraser NW，et al．Analysis of a herpes simplex virus type 1 LATmutant with a deletion between the putative promoter and the 5 end of the 2.0-kilobase transcript．J Virol．1994，68∶ 7816 |
