转化生长因子β调节培养的人角膜基质细胞MMP-2和MMP-9的分泌
眼科研究 2000年第4期第18卷 实验研究
作者:晏晓明 王晓飞 吴静安
单位:晏晓明 吴静安(100034 北京医科大学第一医院眼科);王晓飞(博士研究生,现在首都医科大学附属北京同仁医院100730)
关键词:转化生长因子β;基质细胞;角膜成纤维细胞
摘要 目的观察转化生长因子β(TGF-β)对培养的人角膜基质细胞分泌MMP-2和MMP-9的调节作用,探讨TGF-β治疗非感染性角膜溃疡的潜在可能性。方法采用酶谱法检测人角膜基质细胞MMP-2和MMP-9的分泌,并观察TGT-β对MMP-2和MMP-9分泌的调节作用。结果培养的人角膜基质细胞分泌MMP-2和MMP-9,TGF-β抑制MMP-9的活性,且随TGF-β质量浓度增加而增强,随TGF-β作用时间延长而增强;对MMP-2的活性,TGF-β有较弱的促进作用。结论TGF-β作为一种MMP-9的抑制剂,在促进非感染性角膜溃疡愈合方面很有潜力。 分类号 R772
TGF-β modulates secretion of MMP-2 and MMP-9 by cultured human corneal keratocytes
Yan Xiaoming Wang Xiaofei Wu Jing’an
(Department of Ophthalmology,the First Hospital,Beijing MedicalUniversity,Beijing 100034)
Abstract ObjectiveTo observe modulation of TGF-β for secretion of MMP-2 and MMP-9 by cultured human corneal keratocytes and investigate the possibility of treatment of non-infectious corneal ulcer with TGF-β.MethodsThe second~third passage cells were seeded at proper density,incubated with TGF-β of different concentration(0,0.1,1,5ng/ml)or for different time(24,48,72h).The supernatants were collected and checked.Zymography was applied to test secretion of MMP-2 and MMP-9 by human corneal keratocytes.To observe the TGF-β’s effect on the secretion,the zymography results were examined by densitometric analysis.ResultsCultured human corneal keratocytes secreted MMP-2 and MMP-9.TGF-β inhibited the activation of MMP-9 and the inhibition was dose-dependent and time-dependent.TGF-β mildly promoted the activation of MMP-2. ConclusionCultured human corneal keratocytes secrete MMP-2 and MMP-9.Being an inhibitor of MMP-9,TGF-β may be very potential in improving the healing of non-infectious corneal ulcer.
Key words transforming growth fact
在角膜溃疡发生发展过程中,能降解角膜基质细胞外基质的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)起着重要的作用。转化生长因子β(transforming growth factor beta,TGF-β)是一类具有多种生物学功能的多肽类生长因子,能调节多种细胞的生长、分化和移行,参与调节细胞外基质的合成,在伤口愈合中起重要作用。TGF-β可抑制兔角膜基质细胞中MMP-1,MMP-3的表达,对MMP-2表现为促进作用。然而,TGF-β对人角膜基质细胞MMPs表达如何调节尚不清楚。
1 材料与方法
1.1 细胞来源:体外培养的传2~3代的人角膜基质细胞,处于指数增生期,60%~70%汇合。 1.2 不同剂量TGF-β作用组样本制备
常规消化细胞,制备单细胞悬液。取24孔板,每孔接种1×105个细胞,置于37℃,5%CO2恒温培养箱中培养1天,换用不含FBS的DMEM培养液,同样条件培养1天。D-Hanks液洗3次,将24孔板分为4组,每组6孔,分别加入DMEM培养液及含0.1,1,5ng/mlTGF-β的DMEM培养液。置于37℃,5%CO2恒温培养箱中培养72h后,收集培养液。
1.3 不同时间TGF-β作用组样本制备
制备单细胞悬液及培养方法同上。D-Hanks液洗3次,将24孔板分为6组,每组4孔,其中3组加入DMEM培养液为对照组,另3组加入含1ng/mlTGF-β的DMEM培养液为作用组,置于37℃,5%CO2恒温培养箱中培养。于24,48,72h分别收集1组对照组和1组作用组的培养液。
1.4 酶谱法
取40μl各组样本培养液,加入10μl上样缓冲液,室温下孵育10min。按预定顺序加样于含明胶的丙烯酰胺凝胶孔中,每孔上样量相同,以80V电压电泳,进入分离胶后,改为100V继续电泳至溴酚兰到达分离胶底部,关闭电源。取下电泳后的丙烯酰胺凝胶,置于100ml 2.5%Triton X-100中,室温轻摇1h。换为显色缓冲液,37℃孵育过夜。固定液固定凝胶3h,考马斯亮蓝R250显色液显色至满意,脱色液脱色。拍摄凝胶照片,留作永久实验记录。取不同样本重复实验3次。取其中典型者进行光密度扫描。
1.5 抑制实验:显色缓冲液中加入10mmol/L EDTA,其他步骤同上。
2 结果
本实验的酶谱结果中可以看到3条带。分别位于相对分子质量为92×103,72×103,68×103处,相应的明胶酶是92×103-明胶酶(MMP-9),72×103-明胶酶(MMP-2)和MMP-2的活性形式。
光密度扫描结果见表1和表2。
根据酶谱法结果和光密度扫描值可以发现(表1,2):TGF-β可以抑制MMP-9的活性,但对MMP-2的活性则有刺激作用。0.1ng/ml的TGF-β即可明显地抑制MMP-9的活性(约65%),1ng/ml的 TGF-β对MMP-9活性的抑制作用更为明显(约86%),而在5ng/ml TGF-β作用的样本中,已经看不到蛋白分解带,MMP-9的活性几乎已完全被抑制。TGF-β对MMP-9活性的抑制作用随时间的延长而增强,1ng/mlTGF-β作用1天后,MMP-9的活性约37%被抑制,两天后,87%的活性被抑制,3天后则看不到蛋白分解带,MMP-9的活性几乎完全被抑制。
表1 不同质量浓度TGF-β作用后MMP-2,MMP-9的光密度分析
表2 TGF-β作用不同时间后MMP-2,MMP-9的光密度分析
对于MMP-2,TGF-β的作用则不同。TGF-β对相对分子质量为72×103 MMP-2的前酶形式和相对分子质量为68×103的活性形式均有一定的刺激作用。各质量浓度TGF-β对MMP-2的刺激作用差别不太明显,对72×103 MMP-2的刺激作用为1.06~1.3倍,1ng/ml的TGF-β作用最明显,可使MMP-2的活性增强1.3倍。我们检测了TGF-β在不同时间对MMP-2的作用发现,第2天时,TGF-β对MMP-2的刺激作用最高,第1天和第3天时仅分别使MMP-2的活性增强至1.06和1.08倍。相对于72×103 MMP-2的前酶形式而言,TGF-β对68×103MMP-2的活性形式的刺激作用要强一些,各质量浓度TGF-β对其刺激作用仍以1ng/ml的TGF-β最为明显(1.84倍),但与其他质量浓度的作用差别不太明显,各时间点1ng/ml的TGF-β对MMP-2活性形式的作用几乎无变化,为1.74~1.79倍。
在抑制实验中,显色缓冲液中加入了EDTA,EDTA是一种钙离子螯合剂,能够阻断钙离子的作用,结果凝胶中见不到蛋白分解带,MMP-2,MMP-9的活性完全被抑制。因为MMP是一种钙离子依赖的蛋白分解酶,本抑制实验从另一方面证明了实验中所见到的确系MMP的作用。
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