转化生长因子β调节培养的人角膜基质细胞MMP-2和MMP-9的分泌
眼科研究 2000年第4期第18卷 实验研究
作者：晏晓明 王晓飞 吴静安
单位：晏晓明 吴静安（100034 北京医科大学第一医院眼科）；王晓飞（博士研究生，现在首都医科大学附属北京同仁医院100730）
关键词：转化生长因子β；基质细胞；角膜成纤维细胞
摘要 目的观察转化生长因子β(TGF-β)对培养的人角膜基质细胞分泌MMP-2和MMP-9的调节作用，探讨TGF-β治疗非感染性角膜溃疡的潜在可能性。方法采用酶谱法检测人角膜基质细胞MMP-2和MMP-9的分泌，并观察TGT-β对MMP-2和MMP-9分泌的调节作用。结果培养的人角膜基质细胞分泌MMP-2和MMP-9，TGF-β抑制MMP-9的活性，且随TGF-β质量浓度增加而增强，随TGF-β作用时间延长而增强；对MMP-2的活性，TGF-β有较弱的促进作用。结论TGF-β作为一种MMP-9的抑制剂，在促进非感染性角膜溃疡愈合方面很有潜力。
分类号 R772
TGF-β modulates secretion of MMP-2 and MMP-9 by cultured human corneal keratocytes
Yan Xiaoming Wang Xiaofei Wu Jing’an
（Department of Ophthalmology，the First Hospital，Beijing MedicalUniversity，Beijing 100034）
Abstract ObjectiveTo observe modulation of TGF-β for secretion of MMP-2 and MMP-9 by cultured human corneal keratocytes and investigate the possibility of treatment of non-infectious corneal ulcer with TGF-β．MethodsThe second～third passage cells were seeded at proper density，incubated with TGF-β of different concentration（0，0．1，1，5ng／ml）or for different time（24，48，72h）．The supernatants were collected and checked．Zymography was applied to test secretion of MMP-2 and MMP-9 by human corneal keratocytes．To observe the TGF-β’s effect on the secretion，the zymography results were examined by densitometric analysis．ResultsCultured human corneal keratocytes secreted MMP-2 and MMP-9．TGF-β inhibited the activation of MMP-9 and the inhibition was dose-dependent and time-dependent．TGF-β mildly promoted the activation of MMP-2． ConclusionCultured human corneal keratocytes secrete MMP-2 and MMP-9．Being an inhibitor of MMP-9，TGF-β may be very potential in improving the healing of non-infectious corneal ulcer．
Key words transforming growth fact
在角膜溃疡发生发展过程中，能降解角膜基质细胞外基质的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs）起着重要的作用。转化生长因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)是一类具有多种生物学功能的多肽类生长因子，能调节多种细胞的生长、分化和移行，参与调节细胞外基质的合成，在伤口愈合中起重要作用。TGF-β可抑制兔角膜基质细胞中MMP-1，MMP-3的表达，对MMP-2表现为促进作用。然而，TGF-β对人角膜基质细胞MMPs表达如何调节尚不清楚。
1 材料与方法
1．1 细胞来源：体外培养的传2～3代的人角膜基质细胞，处于指数增生期，60％～70％汇合。
1．2 不同剂量TGF-β作用组样本制备
常规消化细胞，制备单细胞悬液。取24孔板，每孔接种1×105个细胞，置于37℃，5％CO2恒温培养箱中培养1天，换用不含FBS的DMEM培养液，同样条件培养1天。D-Hanks液洗3次，将24孔板分为4组，每组6孔，分别加入DMEM培养液及含0．1，1，5ng／mlTGF-β的DMEM培养液。置于37℃，5％CO2恒温培养箱中培养72h后，收集培养液。
1．3 不同时间TGF-β作用组样本制备
制备单细胞悬液及培养方法同上。D-Hanks液洗3次，将24孔板分为6组，每组4孔，其中3组加入DMEM培养液为对照组，另3组加入含1ng／mlTGF-β的DMEM培养液为作用组，置于37℃，5％CO2恒温培养箱中培养。于24，48，72h分别收集1组对照组和1组作用组的培养液。
1．4 酶谱法
取40μl各组样本培养液，加入10μl上样缓冲液，室温下孵育10min。按预定顺序加样于含明胶的丙烯酰胺凝胶孔中，每孔上样量相同，以80V电压电泳，进入分离胶后，改为100V继续电泳至溴酚兰到达分离胶底部，关闭电源。取下电泳后的丙烯酰胺凝胶，置于100ml 2．5％Triton X-100中，室温轻摇1h。换为显色缓冲液，37℃孵育过夜。固定液固定凝胶3h，考马斯亮蓝R250显色液显色至满意，脱色液脱色。拍摄凝胶照片，留作永久实验记录。取不同样本重复实验3次。取其中典型者进行光密度扫描。
1．5 抑制实验：显色缓冲液中加入10mmol／L EDTA，其他步骤同上。
2 结果
本实验的酶谱结果中可以看到3条带。分别位于相对分子质量为92×103，72×103，68×103处，相应的明胶酶是92×103-明胶酶(MMP-9），72×103-明胶酶(MMP-2)和MMP-2的活性形式。
光密度扫描结果见表1和表2。
根据酶谱法结果和光密度扫描值可以发现(表1，2)：TGF-β可以抑制MMP-9的活性，但对MMP-2的活性则有刺激作用。0．1ng／ml的TGF-β即可明显地抑制MMP-9的活性(约65%)，1ng／ml的 TGF-β对MMP-9活性的抑制作用更为明显（约86%），而在5ng/ml TGF-β作用的样本中，已经看不到蛋白分解带，MMP-9的活性几乎已完全被抑制。TGF-β对MMP-9活性的抑制作用随时间的延长而增强，1ng／mlTGF-β作用1天后，MMP-9的活性约37%被抑制，两天后，87%的活性被抑制，3天后则看不到蛋白分解带，MMP-9的活性几乎完全被抑制。
表1 不同质量浓度TGF-β作用后MMP-2，MMP-9的光密度分析
表2 TGF-β作用不同时间后MMP-2，MMP-9的光密度分析
对于MMP-2，TGF-β的作用则不同。TGF-β对相对分子质量为72×103 MMP-2的前酶形式和相对分子质量为68×103的活性形式均有一定的刺激作用。各质量浓度TGF-β对MMP-2的刺激作用差别不太明显，对72×103 MMP-2的刺激作用为1．06～1．3倍，1ng／ml的TGF-β作用最明显，可使MMP-2的活性增强1．3倍。我们检测了TGF-β在不同时间对MMP-2的作用发现，第2天时，TGF-β对MMP-2的刺激作用最高，第1天和第3天时仅分别使MMP-2的活性增强至1．06和1．08倍。相对于72×103 MMP-2的前酶形式而言，TGF-β对68×103MMP-2的活性形式的刺激作用要强一些，各质量浓度TGF-β对其刺激作用仍以1ng／ml的TGF-β最为明显(1．84倍)，但与其他质量浓度的作用差别不太明显，各时间点1ng／ml的TGF-β对MMP-2活性形式的作用几乎无变化，为1．74～1．79倍。
在抑制实验中，显色缓冲液中加入了EDTA，EDTA是一种钙离子螯合剂，能够阻断钙离子的作用，结果凝胶中见不到蛋白分解带，MMP-2，MMP-9的活性完全被抑制。因为MMP是一种钙离子依赖的蛋白分解酶，本抑制实验从另一方面证明了实验中所见到的确系MMP的作用。
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