【摘要】目的：研究内源性大麻素（AEA）对体外培养牛眼小梁细胞形态和细胞骨架的影响，探讨大麻素在原发性开角性青光眼（POAG）中的降眼压的机制，为大麻素的眼部用药提供帮助。
方法：原代培养的牛眼小梁细胞，经不同质量浓度的AEA作用后，于光学显微镜下观察小梁细胞形态的改变，免疫荧光染色后在荧光显微镜下观察肌动蛋白微丝束的形态改变。免疫组化(SABC法) 对atubulin（微管蛋白）染色，结果以计算机图像分析系统分析, 并统计学检验。
结果：经AEA作用后的牛眼小梁细胞，细胞间隙扩大,细胞变圆,细胞立体感增强;肌动蛋白微丝纤维变稀疏,断裂，排列紊乱。各浓度组与对照组比较，微管蛋白的含量减少，其下调呈浓度依赖性。
结论：大麻素可改变体外培养的小梁细胞的形态和细胞骨架，引起细胞内的微管蛋白含量的减少，有利于降低小梁网房水引流阻力。
【关键词】 小梁网细胞；内源性大麻素；细胞形态；肌动蛋白微丝；微管蛋白；POAG
Effect of endogenous AEA on the morphology and cytoskeleton of bovine trabecular meshwork cells cultured in vitro
SongLin Sun, DeXiu Zhang, BoXia Guo
Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Medical College, Xian Jiaotong University, Xian 710061, Shaanxi Province, China; Yunchen Central Hospital, Yunchen 030003, Shanxi Province, China
Abstract
AIM: To study the effect of endogenous AEA on the morphology and cytoskeleton of bovine trabecular meshwork cells cultured in vitro, and to investigate the mechanism of AEA lowering eye pressure in primary openangle glaucoma (POAG), in order to provide help in AEA medication in ocular region.
METHODS: Primarily cultured bovine trabecular meshwork cells, after treated by different mass concentration AEA, were observed under light microscope to detect cell morphology changes and under fluorescence microscope, after immunofluorescence stain,to detect actin microfilament bundle changes. Immunohistochemical method (SABC) stained atubulinthe and the results were analyzed by computer image analysis system and statistically tested.
RESULTS: After AEA treatment, bovine trabecular meshwork cell spaces increased, with more rounded and stereoscopic morphology, actin filaments became sparse, disrupted and abnormally aligned. Comparing all concentration groups with control group, microtubulin content was decreased in concentration dependent fashion.
CONCLUSION: Certain mass concentration of AEA may change the morphology and cytoskeleton of trabecular meshwork cells culturedin vitro, induce the decrease of cell microtubulin content, in favor of lowering aqueous fluid drainage resistance in trabecular meshwork.
KEYWORDS: trabecular meshwork cells; endogenous AEA; cells morphology; actin filaments; atubulin; POAG
0引言
原发性开角型青光眼是全世界主要致盲疾病之一, 迄今为止, 其病因及发病机制尚不清楚。现已证明, 原发性开角型青光眼的眼压升高是由于房水排出通道的病变, 使房水排出阻力增加所致。房水流出通道大部分衬覆有小梁细胞, 研究证明小梁细胞具有多种功能, 诸如吞噬、收缩、合成及分解糖蛋白, 产生前列腺素等生物活性物质, 这些功能使得小梁细胞在房水排出的生理和病理过程中具有重要影响[1]，而小梁细胞的这些功能活动均以细胞骨架为基础。大麻素是一种众所周知的影响精神活动的物质，又是一种具有潜在医用价值的药物，已有很多实验证实大麻素可以降低眼压。目前研究最多的内源性大麻素是花生四氢酸氨基乙醇（anandamine，AEA）和2花生四稀酸甘油（2arachidonoylglycerol， 2AG）。
图1与AEA使细胞密度降低,间隙扩大;细胞变圆,突起减少,且随浓度的增加变化越来越明显(相差显微镜 ×200)（略）
A:对照组;B:10 7mol/L; C:10 6mol/L , D:10 5mol/L
1材料和方法
1.1材料 取屠宰场新杀小牛牛眼, 4℃冰桶运回实验室,处死后2 h内取材。高糖型DMEM培养基购自Gibco公司,胎牛血清购自杭州四季青生物工程公司。神经元特异性烯醇化酶(NSE) 、波形蛋白( vimentin)及Ⅷ因子相关抗原( ⅧR: Ag)mAb由第四军医大学病理教研室提供。Alexa488标记的鬼笔环肽(Alexaphalloidin ,美国Sigma 公司产品) 。羊抗兔atubulin及相关试剂盒购自华美公司。Zoom2000 型解剖显微镜(德国Leica 公司产品) , CO2 培养箱(美国Napco 公司产品) ,倒置相差显微镜和荧光显微镜(均为日本Olympus 公司产品)。
1.2方法 采用组织块培养法培养小梁网细胞。小梁网细胞游离出组织块后,每周换液1～2次。待细胞长满瓶底后,消化传代。取第3代牛小梁网细胞接种于预置盖玻片的培养皿中,待细胞贴壁2d后用40g/L多聚甲醛固定,行NSE，vimentin及ⅧR: Ag免疫组织化学染色。在预置盖薄片的24孔板内,用同一细胞系细胞,以2×104个/孔接种密度制作细胞爬片,待细胞生长至基本汇合时,血清饥饿过夜。实验细胞分成4组:对照组，浓度分别为107mol/L,10 6mol/L , 10 5mol/L 的AEA3组.每组6孔板,各组均在无血清DMEM37℃、50mL/L CO2 培养箱孵育24h。同一细胞爬片,不同条件作用后标记,迅速置于倒置相差显微镜下,同一部位观察、照相。取其中的12张标本,每组3张,用冰PBS 迅速冲洗各组细胞爬片3 次20g/L多聚甲醛固定20min ;PBS充分冲洗后,加入1.2g/L Triton X—100 反应5min ; PBS冲洗3 次,以PBS 稀释的Alexa488标记的鬼笔环肽避光作用1h;用含Triton X—100 的PBS 冲洗3 次,600g/L甘油封片。荧光显微镜下观察肌动蛋白细胞骨架。另取不同组别共12张标本，每组3张，进行免疫组化染色，具体方法见参考文献[2]。然后标本行计算机图象分析，计算微管蛋白的灰度值。
统计学处理：采用SPSS10.0统计软件进行分析，以±s表示，组间比较用t检验。
2结果
2.1小梁细胞形态 牛眼小梁细胞原代培养5～12d后细胞从组织块向外生长,细胞轮廓清,形态各异, 2wk左右细胞围绕组织块周围形成单细胞层。融合后细胞轮廓欠清,以上皮型为主。传至第3代的小梁网细胞有稳定的形态结构,可见胞突和分支。透射电镜见细胞胞质丰富,微丝于双层核膜周围可见,核仁明显。NSE染色阳性, ⅧR: Ag染色阴性, vimentin染色阳性,证实了小梁细胞的神经外胚层神经嵴间充质来源[3] 。相差显微镜下观察,经AEA作用后的牛眼小梁细胞变圆,突起减少，细胞间连接受到破坏,面积增大，立体感增强, 细胞间隙扩大, 细胞容易从爬片上脱落，并且随着AEA浓度的增加，这些变化越来越明显(图1)。
2.2小梁细胞细胞骨架 荧光显微镜下观察,对照组的肌动蛋白纤维清晰可见，呈细丝状，沿着细胞的长轴分布(图2A)。相对于对照组，AEA组的肌动蛋白纤维断裂变短；排列紊乱，稀疏，发生弯曲。尤其以浓度组105mol/L的变化为明显(图2D)。提示肌动蛋白微丝的聚合状态发生改变。
2.3小梁细胞微管蛋白含量 各浓度组与对照组的a微管蛋白含量比较, 差异均有显著性( P<0.01);随着浓度的升高,各组的含量依次减少( 灰度值分别为186.25±15.84，170.30±7.88，132.70±10.35，110.67±15.20，P<0.05)。说明其减少呈浓度依赖性。
图2AEA使肌动蛋白纤维变稀,排列紊乱，断裂,弯曲（荧光显微镜 ×800） （略）
A:对照组;B:10 7mol/L; C: 10 6mol/L; D:10 5mol/L
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