作者：闫峰　蔡莉　惠延年　王雨生　孟浩   

    作者单位：(710032) 中国陕西省西安市,第四军医大学西京医院眼科

    【摘要】目的：观察自体TGFβ2-DC对于同种异体角膜移植术后免疫排斥反应的调节作用。方法：PBS或已摄取供体抗原的自体TGFβ2-DC经小鼠尾静脉注射7d后，建立小鼠同种异体角膜移植模型，临床观察两组植片混浊程度等情况，比较植片存活时间。 结果：TGFβ2-DC注射后，植片发生移植排斥反应的时间延迟，植片存活时间明显延长，PBS组及TGFβ2-DC尾静脉组植片的存活时间分别为17.8±3.01d和37.6±1.65d（P < 0.01）。结论：摄取供体抗原的不成熟自体DC可以诱导受体获得供体抗原的特异性免疫耐受，使小鼠同种异体角膜移植的免疫排斥反应延迟，植片存活时间明显延长。

    【关键词】  树突状细胞　角膜移植　角膜移植排斥反应　转化生长因子-β2

    Suppression effects of TGFβ2-DC on corneal allograft rejection

    Feng Yan, Li Cai, Yan-Nian Hui, Yu-Sheng Wang, Hao Meng

    Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No.30500550)

    Department of Ophthalmology, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi Province, China

    Abstract　 AIM: To observe the suppression effect of syngeneic TGFβ2-DC on corneal allograft rejection. METHODS: PBS or TGFβ2-DC incubated with donor antigen was injected into murine tail vein. Seven days after the injection, the corneal allograft transplantations were performed and eyes were evaluated by clinical observation.RESULTS: After TGFβ2-DC injection, the corneal allograft rejection was delayed and the survival time of grafts was prolonged. The mean survival time of PBS injection group and TGFβ2-DC injection group was 17.8±3.01d and 37.6±1.65d, respectively (P< 0.001).  CONCLUSION: The immature syngeneic TGFβ2-DC captured with donor antigen can induce donor-specific immune tolerance in the recipients, in which the corneal allograft rejection is delayed and the allograft survival time is prolonged.

    · KEYWORDS: dendritic cells; corneal transplantation; corneal graft rejection; transforming growth factor-β2

    0 引言

    角膜移植是治疗不可逆角膜盲的最重要手段，尽管在所有固体器官移植中，角膜移植是成功率最高的手术，但术后的免疫排斥反应，仍是导致手术失败的主要原因[1]。因此，成功建立角膜移植实验模型，研究角膜移植术后的排斥反应的病理过程及作用机制具有重要意义[2]。树突状细胞（dendritic cells，DC）是目前发现的功能最强的专职性抗原提呈细胞（antigen-presenting cells，APC)，一方面具有诱导免疫反应的功能，被应用于肿瘤及病毒感染等疾病的治疗[3]；另一方面能够诱导免疫耐受，也被尝试用于器官移植排斥反应和自身免疫性疾病的治疗[4]。有学者研究认为转化生长因子（transforming growth factor, TGF）β2可促使DC维持在不成熟状态，这种未成熟DC（immature dendritic cells，iDC）可以诱导T淋巴细胞的低应答，在诱导移植免疫耐受中发挥着重要作用[5]。因此，我们建立小鼠同种异体角膜移植模型中，通过受体尾静脉注射已摄取供体抗原的自体TGFβ2-DC，观察TGFβ2-DC对角膜移植术后免疫排斥反应的是否具有抑制作用。

    1材料和方法

    1.1材料 Balb/c(H-2d)及C57BL/10(H-2b)，6～8wk龄，雌性，由第四军医大学实验动物中心培育。两种小鼠的的主要组织相容性抗原（MHC） 及次要组织相容性抗原（minorH）均不同。取Balb/c小鼠并将其脱颈处死，取出股骨用RPMI1640培养液（Gibco）冲洗出骨髓细胞。吸取含骨髓细胞RPMI1640，入离心管内，离心400r/min，5min，吸取上层油脂并弃去。200目筛网过滤后，离心1 000 r/min, 7min，弃上清。加入含100mL/L FCS RPMI1640吹打均匀后，加入percoll液( Sigma) 中离心2 500 r/min, 25min。离心后可见分层细胞，中间为单核细胞层，下层为红骨髓，缓慢吸出单核细胞层。吸出细胞加入RPMI1640液中，吹打均匀，离心2 500 r/min, 7min。弃上清，加RPMI1640完全培养液（2mmol/L-谷氨酸，10mmol/L Hepes，100mg/L青霉素100mg/L链霉素，0.05mmol/L 2-巯基乙醇，1mmol/L丙酮酸, 0.1mmol/L非必需氨基酸, 100mL/L FBS），吹打均匀后，接种于培养瓶中。37℃，50 mL/L CO2，孵育3h后，轻轻去除上层悬浮细胞，分别更换含20μg/L GM-CSF，10μg/L IL-4，0.2μg/L TGF-β2（R&D Systems）。2d更换1次培养液，5d收集半悬浮细胞即为iDC。收集C57BL/10小鼠的脾脏、肝脏、胸腺，加入PBS在0℃充分研磨，-70℃ 保存30min，37℃解冻，1 000 r/min，4℃离心15min后 12 000 r/min，4℃离心1h，收集上清即为可溶性抗原（soluble antigen, sAg）。将培养的TGFβ2-DC与4mg/L供体来源的可溶性抗原共孵育4h，PBS充分洗涤，即得到已摄取供体抗原的TGFβ2-DC，备用。

    1.2方法 实验分组A：实验模型每组10例：①自体角膜移植（syngeneic group）受体及供体均为Balb/c小鼠；②同种异体角膜移植（allogeneic group）C57BL/10小鼠为供体，Balb/c小鼠为受体，两种小鼠的的主要组织相容性抗原（MHC）及次要组织相容性抗原（minorH）均不同。B：TGFβ2-DC对于同种异体角膜移植排斥反应作用的观察，将受体（Balb/c小鼠）随机分为2组，每组10只。①对照组给予PBS 0.1mL，尾静脉注射；②实验组给予2×106(0.1mL)已摄取供体抗原的TGFβ2-DC，尾静脉注射。7d后进行小鼠同种异体原位角膜移植术。角膜移植的方法参照蔡莉等[6]的方法进行。即术前im ketamine 25mg/kg和rompun 3mg/kg麻醉动物，右眼滴5g/L复方托品酰胺扩大瞳孔。受体角膜用1.5mm直径环钻(Storz Instrument Co) 定位，25G针头穿刺并注入粘稠剂保持前房深度，用显微剪去除受体角膜；将2mm直径的供体角膜(C57BL/10 或Balb/c)用11-0尼龙缝线（Ethicon, Edinburgh,UK）连续缝合在受体植床上。术后涂抗生素眼膏，次日起在手术显微镜下观察。受体术后发生白内障、前房出血、植片感染等并发症均排除在外。术后1d开始，隔日在手术显微镜下观察小鼠角膜植片混浊、水肿、炎细胞浸润、植床新生血管等角膜排斥反应指标，直至术后45d。评分参照文献[7]进行。排斥反应参数总和为：混浊＋水肿＋炎细胞浸润＋（新生血管×血管大小）。当植片的参数总和≥5或植片混浊≥2，认为植片发生排斥反应。

    统计学处理：数据用均数±标准差表示，采用SPSS统计软件进行两组资料的t 检验，P <0.05时认为有统计学差异。

    2结果

    小鼠骨髓细胞在GM-CSF的诱导下培养，2d时可见细胞集落形成，轻轻震荡培养板，去除上层悬浮细胞。培养5d时，可见细胞集落开始减少，有小部分DC从集落中释放出来，高倍镜下观察，单个细胞体积较大，呈典型的不规则毛刺状突起（图1）。收集5d的DC，CD11c的阳性率超过70%，TGFβ2刺激后，低表达CD86 (CD11c+/CD86+为13.3±2.46)和MHC Class (CD11c+/ MHC Class+为4.9±1.11)。自体角膜移植及同种异体角膜移混浊程度积分、同种异体角膜移植术后植片存活率分别见(图2A，B)。自体角膜移植至实验观察结束时间，即术后45d，植片存活率为100%，即植片混浊均<2或植片的参数之和均<5(图3A)；同种异体角膜移植术后1d，植片基本透明，上皮有轻度水肿；3d部分植片轻度混浊，伴有角膜缘细小新生血管形成；术后7d大部分植片线结处周围可见少量炎细胞浸润，植片混浊程度1级；术后7d至术后12d，植片混浊程度有所下降，可能与术后炎症反应减轻有关；术后13d开始，有部分植片混浊程度达到2级，虹膜不清，但可见瞳孔，以后逐渐加重，同时大多数新生血管长入植片，炎细胞浸润1~2级；术后13~23d，100%植片排斥反应参数之和≥5或植片混浊≥2，被认为发生了排斥反应；植片平均存活时间为17.8±2.86d，植片混浊程度于术后28~35d达到顶峰，以后逐渐有所下降（图3B）。TGFβ2-DC注射组 和 PBS注射组：小鼠角膜移植后植片混浊程度积分、存活率分别见（图4A，B）。PBS尾静脉注射组术后14d植片开始出现免疫排斥反应，混浊程度并逐渐加重，术后21d所有植片均被排斥,至术后35d达到顶峰。TGFβ2-DC尾静脉注射组，植片混浊程度、炎细胞浸润及新生血管等情况均较PBS注射组，进展缓慢：术后1d植片透明，上皮有轻度水肿；术后7d植片仍基本透明，大部分角膜缘开始形成细小新生血管； 15d开始部分植片轻度混浊程度1级，虹膜纹理可见，新生血管未长入植片，炎细胞浸润1级； 35d少数植片出现移植排斥反应，混浊程度达到2级，伴有新生血管长入植片周围； 35~39d 100%植片排斥反应参数之和≥5或植片混浊≥2，被认为发生了排斥反应；到实验观察结束45d，混浊程度仍呈上升趋势。PBS组和TGFβ2-DC尾静脉组植片的存活时间分别为17.8±3.01d和37.6±1.65d，TGFβ2-DC经尾静脉注射后明显延长了同种异体角膜移植片的存活时间（P < 0.01）。

    图 1 体外培养5d的小鼠骨髓来源的树突状细胞（箭头所示）

    图 2 小鼠角膜移植后植片的混浊程度积分和存活率 A：混浊程度积分；B：同种异体角膜移植后植片的存活率

    图 3 小鼠角膜移植术后30d A：自体角膜移植术后 (植片混浊0，水肿1，炎细胞浸润0， 新生血管0.8)；B：同种异体角膜移植术后(植片混浊3， 水肿1，炎细胞浸润2，新生血管1.8)；C：TGFβ2-DC注射小鼠同种异体角膜移植术后 (植片混浊1，水肿0，炎细胞浸润1，新生血管1.2 )

    图 4 小鼠同种异体角膜移植后植片的混浊程度积分和存活率 A：混浊程度积分；B：植片的存活率

[1] [2] 下一页