3讨论

     移植排斥反应是导致角膜移植手术失败的主要原因，因此，研究角膜移植排斥反应的病理过程及发病机制，寻找有效的治疗途径具有重要意义。在大量关于鼠类角膜移植研究中，角膜植片混浊被认为是排斥反应的重要表现，其次还有细胞浸润、植片水肿，新生血管长入等[8]，然而这些表现都会与植片混浊的表现密切相关，因此，目前多数学者都采用Sonoda等[9]的评分标准，认为植片混浊≥2说明发生排斥反应，Plskova等[7]实验发现使用排斥反应参数总和，及植片混浊为评分标准时，两者所得的植片生存曲线基本吻合。我们的实验采用排斥反应参数总和≥5或植片混浊≥2，都被认为植片发生排斥反应。实验中发现：自体角膜移植组，角膜移植术后移植片不发生排斥反应；同种异体角膜移植组，两种小鼠的的主要组织相容性抗原（MHC） 及次要组织相容性抗原（minorH）均不同，移植片存活时间为17.8±2.86d，术后21d，100%植片发生免疫排斥反应。实验结果表明：小鼠同种异体角膜移植排斥反应迟发但最终发生率高，说明角膜的免疫赦免状态不是绝对的；这与人角膜移植术后5a植片存活率比预期低的现象相一致。因此我们此后的实验研究建立在主要组织相容性抗原（MHC） 及次要组织相容性抗原 （minorH）均不同的小鼠的同种异体角膜移植模型之上。

    DC在免疫系统中扮演着双重角色，除作为APC诱发免疫反应外，还能诱导中枢或周围性免疫耐受。作为疫苗免疫动物，可用于肿瘤、病毒细胞感染、移植排斥、自身变态反应等许多疾病的治疗。近年来，越来越多的研究发现，某些亚群或经过体外诱导的DC能够诱发周围免疫耐受，从而延长同种异体移植物的存活时间。Thomson等[10,11]认为，未成熟的自体DC或供体DC作为诱导移植免疫耐受的启动子，通过致敏受体的T细胞诱导免疫耐受，从而使移植物的存活时间延长。Yamazaki等[12]认为，DC通过扩增调节性T细胞（regulatory T cells，Treg），从而有效地抑制移植排斥反应。Oluwole等[13]报道，在移植前7d，通过静脉内注射自体的不成熟髓样DC，通过诱导产生Treg，能成功地延长大鼠同种异体心脏移植的存活时间。Rastellin等[14]在移植前静脉注射供体肝脏来源的DC，延长了异体胰腺的存活时间；而通过转达基因技术使DC高表达IL-10，TGFβ，CTLA-4及IL-12等，能分别延长异体肾脏、肠道等的存活时间[15，16]。

    但决定DC接种动物后最终导致免疫反应还是免疫耐受的关键因素目前还不十分清楚。大量实验表明可能和许多因素有关，如成熟状态、接种的方式，抗原的选择及DC亚型等[17,18]。外周的DC大多数以不成熟状态存在，它能够捕获、处理抗原，但缺乏激活T细胞的能力。随着DC的成熟，DC迁移至外周淋巴器官，在此它们失去捕获抗原的能力，而获得激活初始型T细胞的能力。未成熟DC表面缺乏T细胞活化所必需的辅助信号，如CD40，CD80，CD86，MHC等，因此不能不效激活静止的T细胞。前期实验[19]研究发现，TGFβ2 诱导后DC 表面抗原CD40，CD80，CD86及MHC ClassII 表达都有明显下降，并明显抑制了MLR 中同种异体T 细胞增殖,说明TGFβ2能够通过下调DC表面协同刺激分子的表达，降低DC成熟状态,抑制T 细胞活化、增殖，进一步抑制DC诱导免疫反应的能力。这与Kezuka等[5]研究结果相一致。因此我们继续用TGFβ2刺激下获取iDC， 并检测到TGFβ2刺激后5d的DC低表达CD86和MHC Class。我们的前期实验证实：受体皮下注射自体TGFβ2-DC后，植片混浊发生推迟，存活时间明显延长为26±6.05d；而供体来源的DC皮下注射后，则导致植片混浊发生提前，存活时间缩短；同时也证实结膜下注射自体TGFβ2-DC植片混浊发生提前，存活时间没有延长[19,20]。在此部分实验中我们采用受体TGFβ2 -DC与供体的可溶性抗原相孵育，使DC获得受体抗原特异性，经小鼠尾静脉，目的诱发供体特异性的免疫耐受。本实验结果表明，TGFβ2-DC尾静脉注射后推迟了同种异体角膜移植术后移植片混浊发生的时间，明显延长了移植片的存活时间。对于DC诱导免疫耐受，防治移植物排斥反应的具体机制，还不十分清楚，可能与DC诱导T细胞不应答、T细胞克隆清除、调节性T细胞产生及改变Th细胞分化方向有关，仍需进一步研究。

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