作者：袁容娣　叶剑　彭锡嘉　刘少章   

    作者单位：（400042）中国重庆市，第三军医大学大坪医院野战外科研究所眼科

    【摘要】目的：观察反义寡核苷酸对损伤视神经Nogo-A的影响。方法：实验分为对照组、随机序列组、和2，5，10μmol/L 3种Nogo-A反义寡核苷酸浓度组。大鼠视神经钳夹伤后，采用逆转录-聚合酶链反应法（RT-PCR），半定量分析反义寡核苷酸对损伤视神经Nogo-A mRNA表达量的变化。 结果：反义寡核苷酸均显著降低Nogo-A mRNA的表达 （P <0.01），随机序列对Nogo-A mRNA的表达无影响(P >0.05)。结论：反义寡核苷酸对视神经损伤后Nogo-A mRNA表达有抑制作用。

    【关键词】  反义寡核苷酸　Nogo-A　视神经　创伤　RT-PCR

    Effects of antisense oligodeoxynucleotides on Nogo-A mRNA expression in injured optic nerves

    Rong-Di Yuan, Jian Ye, Xi-Jia Peng, Shao-Zhang Liu

    Foundation items: National Natural Science Foundation of China (No. 30270458); The 15th Medical Research Fund of Chinese PLA (No.01MA175)

    Department of Ophthalmology, Daping Hospital and Research Institute of Surgery, the Third Military Medical University, Chongqing 400042, China

    AbstractAIM: To observe the effects of antisense oligodeoxynucleotides (ASODN) on Nogo-A mRNA expression in injured optic nerves. METHODS: A total of 30 rats were divided into five groups: control group, random sequence group and test groups (2μmol/L, 5μmol/L and 10μmol/L Nogo-A antisense oligodeoxynucleotides). reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) method was used in the detection of the levels of Nogo-A mRNA in injured optic nerves. RESULTS: The result of RT-PCR showed that Nogo-A antisense oligodeoxynucleotides could significantly inhibit the expresson of Nogo-A mRNA (P<0.01), random sequence antisense oligodeoxynucleotides had no noticeable effect on Nogo-A mRNA. CONCLUSION: Nogo-A antisense oligodeoxynucleotides can inhibit the expresson of Nogo-A mRNA in injured optic nerves.

    · KEYWORDS: antisense oligodeoxynucleotides; Nogo-A; optic nerve; injury; reverse transcriptase-polymerase chain reaction

    0引言

    视神经损伤是临床常见的眼外伤，迄今仍缺乏有效的治疗手段。研究证实，微环境中存在神经生长抑制因子是成年中枢神经再生能力低下的原因之一,中和或减少神经生长抑制因子可以促进成年哺乳动物RGCs轴突再生。Nogo-A是最具特征性的神经生长抑制因子。2000年美国、英国、瑞士的3个实验室[1-3] 同时报道Nogo基因成功克隆，它编码3种蛋白（Nogo-A,-B,-C）。Nogo-A具有最强的神经生长抑制作用，其抗体IN-1可以中和这种抑制作用。研究表明[4]，反义寡核苷酸对培养的视神经少突胶质细胞Nogo-A的表达具有抑制作用，我们通过在体实验研究反义寡核苷酸对损伤视神经Nogo-A表达的影响。

    1材料和方法

    1.1材料 8～10wk Wistar雄性大鼠30只，体质量200～250g，由第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供，分为实验组、随机序列组及对照组，每组6只，3个实验组分别用2，5，10μmol/L 反义寡核苷酸10μL球后注射，对照组用注射用水10μL。硫代反义寡核苷酸序列为5-TGC TTT CGG TTG CTG AGG TA-3，浓度定为2μmol/L；同时设计一段随机序列，其序列为5-GCA GAC CAG CGC GGA GCT-3。经基因库检索，Nogo-A反义核酸片段仅与Nogo-A有同源性，而随机序列同所有基因均无同源性。由大连Takara公司进行全硫代修饰（高纯度级）。1.2方法 10g/L戊巴比妥钠0.8mL(30mg/kg)ip麻醉， 暴露视神经，在球后2mm处用动脉夹夹持视神经40s，致伤后按以上分组分别球后注射不同浓度的反义寡核苷酸或注射用水，隔24h给药1次，共2次。伤后3d，断颈处死大鼠，取伤侧视神经置于组织研磨器中研磨匀浆，-70℃冻存备用。采用Trizol试剂提取视神经总RNA。用DU-640型紫外分光光度计进行定量。引物合成:特异性引物设计，采用Premier 5.0软件设计，并经NCBI BLAS向基因库检索验证，与其它基因无高度同源性。由TaKaRa生物公司合成。Nogo-A引物序列，引物1： 5’-GTC CTG CTT GAA ACT GCT-3’；引物2：5’-CTT TCG GTT GCT GAG GTA-3’。 以(-actin作为内参照，引物序列如下，引物 1： 5’-ATC ATG TTT GAG ACC TTC A-3’；引物2：5’-CAT CTC TTG CTC GAA GTC-3’。RT-PCR反应：逆转录反应按照Promega公司M-MLV逆转录酶说明书进行操作。取各实验组反转录产物2μL，按以下条件进行扩增：（1）95°C 变性样品5min；（2）94°C变性30s；（3）50°C 退火40s；（4）72°C延伸60s；（5）返回反应（2），进行29个循环。最后一个循环72°C延伸10min。PCR反应产物10μL加载样缓冲液1μL，以1×TAE为电泳缓冲液，在20g/L 琼脂糖凝胶上电泳约1h(电压100V)。电泳完毕后，将琼脂糖凝胶经LabWorks4.0凝胶用图像分析系统仪进行图像分析。由该系统分析Nogo-A及(-actin的积分光密度值（IOD）。以各组Nogo-A/β-actin积分光密度的比值，作为Nogo-A的表达水平。

    统计学处理：应用单因素方差分析，比较各组Nogo-A表达的差异。采用SPSS10.0统计软件对计量资料进行统计分析（LSD-t 检验）。P <0.05时差异有统计学意义。

    2结果

    实验组（2，5，10μmol/L）与对照组、随机序列组比较，Nogo-A mRNA表达差异显著（P <0.01，图1，2），提示不同剂量2μmol/L反义寡核苷酸对视神经损伤后Nogo-A mRNA表达均有抑制作用。2μmol/L组与5，10μmol/L组比较相差非常显著（P <0.01），5μmol/L与10μmol/L组之间相差不显著（P >0.05）。随机序列组与对照组之间无显著差异 (P >0.05)。提示硫代随机序列对视神经损伤后Nogo-A mRNA的表达无明显影响。

    图1 Nogo-A ASODN对视神经Nogo-A mRNA表达的作用

    图2 ASODN对损伤视神经Nogo-A表达的影响 1.Control; 2.Nogo-A ASODN(2μmol/L); 3.Nogo-A ASODN(5μmol/L);4.Nogo-A ASODN(10μmol/L); 5.Random sequence(10μmol/L);M, Marker

[1] [2] 下一页