3讨论

    视神经损伤是常见的一类眼外伤，预后不良，约有40%～50%的患者失明。在颅脑损伤中，视神经损伤的发生率为0.3%～5.2%。传统的观点认为中枢神经受损后不能再生。然而，近年来许多研究证明在一定条件下，中枢神经可以再生。中枢神经系统髓磷脂是髓鞘的化学成分，是由成熟的少突胶质细胞的质膜生长形成的。1988年Schwab等分离大鼠CNS髓磷脂蛋白，获得两种对神经突生长具有强烈抑制作用的蛋白，分子质量分别为35kDa和250kDa[5,6]。遂提出神经突生长抑制因子（neurite growth inhibitor，NI）的概念。这2种蛋白被称为NI-35/NI250。其mAb IN-1抗体能和NI-35/NI250结合并可以选择性地抑制成熟少突胶质细胞及中枢神经系统白质对轴突再生的抑制作用，促进轴突再生[7-9]。如将产生IN-1抗体的杂交瘤细胞注入大鼠背侧额皮质，然后切断动物的皮质脊髓束，发现损伤部位有大量再生的轴突芽，2～3wk内可观察到长达7～11mm的轴突芽及轴突束，对照组虽然也有再生轴突芽，但其生长很少超过1mm[10]。

    2000年初，科学家成功地克隆了抑制神经再生基因——Nogo。它编码抑制性蛋白NI-35/250。Nogo基因编码长度为3 489bp，通过可变启动子和可变RNA剪接方式，转录的mRNA有3种。对应的蛋白分别称为Nogo-A，B和C。Nogo-A的全长序列对神经生长具有强烈的抑制作用。它是髓鞘源性的神经突生长抑制因子及单克隆抗体IN-1的抗原。IN-1抗体可以中和其抑制作用[7-9,11]Nogo基因的成功克隆，为从基因水平治疗视神经损伤提供了可能。

    Nogo-A对中枢神经再生具有强烈的抑制作用。Nogo基因的发现，为我们从基因水平研究视神经损伤修复提供了一个新途径。反义技术是根据核酸杂交原理设计针对特定靶序列的反义核酸，从而抑制特定基因的表达，高度专一地阻断其靶基因的表达。反义寡核苷酸的优点在于：（1）反义寡核苷酸是遵照靶基因特异性设计合成，只有互补的碱基之间才能够结合。Saison等应用HARAS基因点突变区域的反义寡核苷酸能够选择性地抑制突变基因的表达，而正常基因不受影响。与其它抑制剂比较，这种方法特异性高。（2）反义寡核苷酸较容易合成。（3）导入途径适当，反义核酸有较高的局部反应。反义寡核苷酸可以与靶mRNA杂交，形成RNA/DNA双链，形成空间位阻，阻止翻译过程；形成的RNA/DNA双链可以激活RnaseH，将RNA链降解破坏；通过Hoog-steen碱基配对形式，在基因组的靶基因部位，形成三链结构，阻止靶基因复制或转录[12,13]。由于体内广泛存在的核酸酶，天然寡核苷酸极易被降解，硫代修饰后的寡核苷酸抗核酸酶的能力提高10倍之多。它具有良好的水溶性、稳定性并易于大量合成。为了提高ASODN的抗核酸酶能力，我们对Nogo-A反义寡核苷酸及随机序列均进行了全硫代修饰，大大降低了ASODN的降解。因此，我们应用硫代反义寡核苷酸，对视神经Nogo-A mRNA表达的调控进行了研究。结果表明，浓度为2μmol/L反义寡核苷酸对视神经损伤后Nogo-A mRNA表达有抑制作用；3个实验组之间比较，2μmol/L组与5，10μmol/L组比较相差非常显著（P <0.01），5μmol/L与10μmol/L组之间相差不显著（P >0.05），硫代随机序列对视神经损伤后Nogo-A mRNA的表达无明显影响。

    本研究表明，反义寡核苷酸对视神经损伤后Nogo-A mRNA表达有抑制作用，这可能为治疗视神经损伤提供了新的思路。

    【参考文献】

    1 Chen MS, Huber AB, van der Haar Me, Frank M, Schnell L, Spillmann AA, Christ F, Schwab ME. Nogo-A is a myelin-associated neurite outgrowth inhibitor and an antigen for monoclonal antibody IN-1. Nature ,2000;403:434-439

    2 Prinjha R,Moore SE,Christie G, Vinson M, Blake S, Morrow R, Michalovich D, Simmons DL, Walsh FS. Inhibitor of neurite outgrowth in humans. Nature ,2000;403:383-384

    3 GrandPr T, Nakamura F, Vartanian T, Strittmatter SM. Identification of the Nogo inhibitor of axon regeneration as a Reticulon protein. Nature ,2000;403:439-444

    4彭锡嘉,刘少章,叶剑，袁容娣.反义寡核苷酸对视神经少突胶质细胞Nogo-A mRNA表达调控的实验研究.眼科研究,2003;21(5):485-488

    5 Rubin BP, Dusart I, Schwab ME. A monoclonal antibody (IN-1) which neutralizes neurite growth inhibitory proteins in the rat CNS recognizes antigens localized in CNS myelin. J Neurocytol ,1994;23:209-217

    6 Brosamle C, Huber AB, Fiedler M, Skerra A, Schwab ME. Regeneration of lesioned corticospinal tract fibers in the adult rat induced by a recombinant, humanized IN-1 antibody fragment. J Neurosci ,2000;20:8061-8068

    7 Fournier AE, GrandPre T, Strittmatter SM. Identification of a receptor mediating Nogo-66 inhibition of axonal regeneration. Nature ,2001;409:341-346

    8 Huber AB, Schwab ME. Nogo-A, a potent inhibitor of neurite outgrowth and regeneration. Biol Chem ,2000; 381:407-419

    9 Goldberg JL, Barres BA. Nogo in nerve regeneration. Nature ,2000;403:369-370

    10 Schnell L, Schwab ME. Axonal regeneration in the rat spinal cord produced by an antibody against myelin-associated neurite growth inhibitors. Nature ,1990;343:269-272

    11 Buffo A, Zagrebelsky M, Huber AB. Application of neutralizing antibodies against NI-35/250 myelin-associated neurite growth inhibitory proteins to the adult rat cerebellum induces sprouting of uninjured purkinje cell axons. J Neurosci , 2000;20:2275-2286

    12 Wang S, Lee RJ, Cauchon D. Delivery of antisense oligodeoxyibonucleotides against the human epidermal growth factor receptor into cultured Kbcells with liposomes conjugated to folate via polyethyleneglycol. Proc Natl Acad Sci USA ,1995, 92: 3318-3322

    13 Tari AM, Lopez-Berestein G. Cellular uptake of antisense oligonucleotides. Curr Opin Investig Drugs ,2001;2:1450-1453

    基金项目：中国国家自然科学基金资助项目（No.30270458）；军队十五医学科研基金资助项目（No. 01MA175）

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