作者：庞东渤，符丽娟
作者单位：1（121001）中国辽宁省锦州市，辽宁医学院附属第一医院眼科；2（121001）中国辽宁省锦州市，辽宁医学院药理教研室
【摘要】 目的：观察STZ糖尿病大鼠视网膜微血管病理改变及氨基胍对微血管病变的影响。方法：制备STZ糖尿病大鼠动物模型，随机分为正常对照（CON）组、糖尿病3mo（DM3）组，6mo（DM6）组，氨基胍3mo（AG3）组和6mo（AG6）组。每组大鼠各10只，分别饲养3，6mo。取大鼠视网膜进行视网膜微血管形态及超微结构观察。结果：DM组视网膜周细胞数目随病程逐渐减少，细胞核染色质浓缩，边集，分布于核膜下；胞质内线粒体肿胀，变性，空泡化，胞质消失，基底膜增厚。AG治疗组则明显改善。结论：氨基胍对STZ 糖尿病大鼠视网膜微血管病变有防治作用。
【关键词】 糖尿病视网膜病变；氨基胍；大鼠
Influence of aminoguanidine on retinal microvascular pathological changes in diabetic rats
Dong-Bo Pang1, Li-Juan Fu2
Foundation item: Natural Science Foundation of Liaoning Province, China (No. 002114)
1Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China;2Staff Room of Pharmacology, Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China
AbstractAIM:To observe pathological changes of retinal microv- ascular in diabetic rats and contribution of aminoguanidine. METHODS: Animal models of were induced by streptozotocin and randomly divided into diabetic mellitus (DM3) group, DM6 group, aminoguanidine(AG3)group, AG6 group and control group. The rats were killed after 6 months, their retinas were studied by light and electronic microscope. RESULTS: In DM group, the number of pericyte decreased and chromatin nucleolus concentrated, mitochondrion swelled and denaturalized, basement membrane thickened. The pathological changes of retina were improved in DM group.
CONCLUSION: Aminoguanidine can effectively prevent and cure the damages of retinal capillary in stz-diabetic rats.
· KEYWORDS: diabetic retinopathy; aminoguanidine; rat
0引言
糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病严重慢性并发症之一，其发病机制复杂。DR早期病理改变为周细胞减少，微血管瘤形成，以及毛细血管床的改变。有研究报道，这种病理改变与蛋白质非酶糖化有关[1]。应用蛋白质非酶糖化抑制剂-氨基胍(aminoguanidine，AG)，作用于STZ诱导糖尿病大鼠[2]，观察其对糖尿病大鼠视网膜微血管病变的影响，探讨其对DR的保护作用。
1材料和方法
1.1材料 链脲佐菌素（streptozotocin，STZ），氨基胍（aminoguanidine，AG），胰蛋白酶（Tyspin，difco 1：250）均购于Sigma公司，One-touch Ⅱ血糖仪（美国强生公司生产），透射电镜（1200EX 日本）。选鼠龄2mo，体质量200~250g雄性SD大鼠60只（辽宁医学院实验动物中心提供）。
1.2方法 以60mg/kg一次性ip20g/L STZ溶液，当天即让大鼠自由进食饮水，不限量。注射后48h采尾血测血糖及尿糖，将血糖浓度大于16.7mmol/L，尿糖阳性的大鼠定为糖尿病模型，低于此值者弃去。将糖尿病大鼠随机分为4组，糖尿病3mo（DM3）组、6mo（DM6）组、AG3mo（AG3）组、6mo（AG6）组各10只。AG按每日150mg/kg于饮水中给药。对照组3mo（CON3）及6mo（CON6）各10只注入等量容积缓冲液。各组均在标准条件铁笼中标准饲料，单笼饲养。 DM组及AG治疗组饲养到期后，用200g/L乌拉坦ip麻醉。打开胸腔，暴露心脏，将灌流针于左心室处插入，剪破右心耳，先后用4℃生理盐水和40g/L多聚甲醛灌注固定。取眼球置于40g/L多聚甲醛固定液中固定24h以上。沿锯齿缘环形剪开眼球，水中分离视网膜，流水冲洗3~4h，放入pH=7.8 Tris-HCL缓冲液溶解的30g/LTyspin(Difco 1∶250 )溶液内，37℃温箱孵育3~4h,定期观察。见组织崩解后，将视网膜移至蒸馏水中轻轻冲洗，洗去残留的视网膜神经成分，显微镜下，观察到一层菲薄的半透明血管网，将其移至载玻片上，自然干燥，行PAS染色。 每组随机取2只大鼠行电镜观察。用200g/L乌拉坦0.5~1.0mL麻醉，30g/L戊二醛行心脏灌流，迅速摘除眼球，在垫有冰块的平皿上迅速切眼前节，分离视网膜，以视神经为中心，取颞上及颞下视网膜组织，切成1.5mm×2.0mm长方形小片放入30g/L戊二醛液中固定2h，PBS缓冲液充分洗后，入四氧化锇缓冲液中固定2h，梯度酒精、丙酮逐级脱水，epon 812包埋后，1μm的半薄片作光镜定位，然后做超薄切片，醋酸-柠檬酸铅双重染色，1200EX透射电镜观察。采用MIAS-1000细胞图像分析仪进行图像分析：将视网膜铺片通过摄像系统输入计算机，并在显示屏中显示出来，计数视网膜毛细血管周细胞、内皮细胞的数目，观察毛细血管形态。全部数据经SPSS12.0统计软件处理，数据均以 表示，两组间比较用T检验。
2结果
2.1大鼠的一般状态 饲养过程中，3只大鼠死亡，4只大鼠血糖及尿糖恢复正常。DM组大鼠饮水量及尿量明显增加,体增长缓慢，并伴有不同程度的精神萎靡，皮毛稀疏无光泽；AG组大鼠精神状态较好。DM组和AG组血糖始终在较高水平波动（表1）。
2.2视网膜微血管形态 通过对PAS染色视网膜铺片的观测，正常视网膜毛细血管网管径粗细均匀一致，内皮细胞核长呈椭圆形、染色淡，周细胞核呈圆形、染色深。随着病程的延长，DM组视网膜血管周细胞的数量明显减少，DM组6mo较3mo时减少更明显，与CON组比较具有显著性差异（P＜0.01）。AG组周细胞数量减少不明显，与DM组比较差异具有显著性（P＜0.05），与CON组相比差异无显著性（P＞0.05）。内皮细胞数量各组间差异均无显著性（P＞0.05）。DM 组视网膜血管迂曲，走行不规则，可见多处毛细血管闭塞，AG组上述改变明显减轻。
2.3微血管超微结构 视网膜毛细血管由周细胞、内皮细胞及毛细血管基底膜构成。周细胞及内皮细胞的核膜完整，染色质分布均匀，细胞器及核形态正常。内皮细胞位于管腔面，外侧有连续的基底膜和周细胞包绕，基底膜电子密度均匀，结构清楚，连续完整。DM组毛细血管内皮细胞水肿、变形，向血管腔内指状突起，有微绒毛形成。细胞质减少，核形态不规则，异染色质聚集、靠边，管腔明显狭窄，甚至闭塞。周细胞胞质内线粒体肿胀变性，甚至空泡化，核染色质浓缩、边集。有的细胞内结构消失，仅残留少许细胞器。基底膜呈节段样明显增厚，可见毛细血管壁断裂。AG组毛细血管管腔较规则,内皮细胞核形态完整,胞质内部分线粒体肿胀变性。周细胞核染色质浓缩、边集，胞质内线粒体肿胀，偶见空泡化。基底膜稍模糊，无节段性增厚。
3讨论
DR的发病机制至今尚未完全阐明，病理改变主要有毛细血管周细胞减少，内皮细胞增生以及基底膜的增厚，其综合结果是毛细血管闭塞。DR早期临床改变为微血管瘤形成，点状出血，硬性渗出及毛细血管无灌注，这些改变与视网膜毛细血管结构损伤有关。人及动物的视网膜微循环内屏障为视网膜毛细血管中的内皮细胞、连续的基底膜及无细胞间隙的周细胞构成的血-视网膜屏障（blood retinal barrier BRB）。BRB的破坏是DR的标志之一，是引起糖尿病患者失明的最常见原因[3]。本研究结果显示，病程6mo糖尿病大鼠视网膜毛细血管内皮细胞、周细胞变性，线粒体空泡化，内皮细胞微绒毛形成，基底膜增厚，管腔变窄。Hosoda等[4]发现，毛细血管内皮细胞及周细胞的这种改变会导致毛细血管通透性增加，基底膜对维持血管壁的通透性也起着重要作用，基底膜的增厚和损伤可使视网膜出现渗出性改变。我们用AG治疗的糖尿病大鼠视网膜毛细血管病变较轻，AG是一种非酶糖化抑制剂，表明在DR中，非酶糖化有着重要作用。非酶糖化（NEG）是指还原性单糖的醛基或酮基，在无任何酶参与下，即可与蛋白、核酸及脂质上的游离氨基发生自发缩合反应，再经过一系列复杂反应，形成糖化终产物（AGES）。研究表明，NEG及其产物AGEs是糖尿病慢性并发症的最主要原因之一[5]。当血中葡萄糖浓度升高时，可与蛋白形成可逆的早期糖化产物（Schiff碱）。这些Schiff碱经过重排形成更稳定的但仍可逆转的Amadori型早期糖化产物。血糖正常后，早期糖化产物降至正常。然而一些位于血管壁胶原和其它蛋白上的早期糖化产物并不降解，而是经过缓慢的复杂化学重排形成不可逆转的AGEs[6]。糖尿病时微血管壁胶原蛋白易发生NEG，形成AGEs。AGEs堆积于内皮细胞及基底膜，从而导致RBM增厚。并影响视网膜毛细血管周细胞和内皮细胞的生理功能，对触发DR起着重要作用[7]。长期高血糖导致细胞及细胞外基质发生非酶糖化和糖基化终产物（AGEs）的形成及堆积，可通过多种途径破坏血-视网膜屏障，引起视网膜毛细血管病变[8]。本研究中， AG治疗组毛细血管结构改变较轻，基底膜无明显增厚，提示AG有效的阻断NEG的发生，减少了AGEs的生成及在组织的沉积。其减少AGEs的生成机制可能是AG分子上的-NH2竞争性地抑制蛋白上的-NH2发生非酶糖化；与早期的糖化产物Amadori产物结合，阻断其进一步反应生成AGEs[9]。本研究结果提示AGEs在DR过程中起着重要作用，AG对DR有防治作用。
基金项目：中国辽宁省自然科学基金资助（No. 002114）
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