2   结   果

    2.1   PSMB5的PCR结果

    目的基因PSMB5扩增后于10 g/L琼脂糖电泳,根据所设计的PSMB5基因的PCR引物可知目的基因大小约为792 bp，电泳后获得的片段与预计相符（图1）。

    2.2   重组质粒的鉴定结果

    以重组质粒为模板PCR扩增，琼脂糖电泳可见一约792 bp条带。重组质粒经EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切后电泳，可见一约792 bp条带，与预计相符（图2）。

    2.3   pcDNA3.1－PSMB5基因测序结果

    重组质粒pcDNA3.1－PSMB5由Invitrogen公司进行基因测序，结果显示，各连接位点正确，表达框架与已知相符。

    2.4   半定量RT-PCR结果

    分别提取为未转染组、空载体pcDNA3.1组及PSMB5转染组细胞的总RNA，做RT-PCR，结果如图3。转染组PSMB5基因的mRNA明显高于其他组（图3）。

    2.5   Western blot 检测蛋白表达结果

    分别提取空载体转染细胞及PSMB5转染细胞的蛋白，Western blot检测PSMB5蛋白表达情况，结果如图4。PSMB5转染细胞的蛋白酶体PSMB5亚单位蛋白表达明显高于空载体转染组。

    2.6   H2O2对细胞增殖的影响

    H2O2处理4 h后，PSMB5转染组及空转染组增殖受到抑制，而空转染组比PSMB5转染组降低更为明显，统计学具有显著性差异。

    3   讨   论

    蛋白酶体系统是由泛素、蛋白酶体以及介导泛素和蛋白酶体相互作用的酶类组成，主要具有糜蛋白酶样、胰蛋白酶样、天冬氨酸特异性蛋白水解酶样三种蛋白酶活性，是细胞内蛋白降解的重要途径之一[6]。近年来的研究表明，泛素－蛋白酶体途径参与介导细胞活动过程，如：细胞周期的进展、转录、凋亡、细胞生长、机体的发育等[7]，而在年龄相关性疾病、癌症、代谢性疾病以及炎症免疫过程中，泛素蛋白酶体途径起着重要作用[8，9]。

    蛋白酶体β5亚单位PSMB5位于蛋白酶体的核心部分，具有糜蛋白酶活性，是蛋白酶体的主要酶活性之一。PSMB5在蛋白酶体的组装、成熟以及发挥蛋白水解功能中都起主导作用。研究结果提示，PSMB5亚单位通过其糜蛋白酶样酶活性降解异常氧化的蛋白质，防止这类蛋白质在晶状体内蓄积，从而对维持晶状体透明性发挥重要作用。

    近年来的研究普遍认为氧化损伤是导致年龄相关性白内障发生的首要危险因素，各种原因和途径引起的氧自由基产生过多或清除减少，均可导致氧自由基在晶状体内蓄积。研究证实，晶状体混浊之前就己经有氧自由基造成的损伤，任何促使自由基产生增加的因素都能引起白内障形成。晶状体的上皮及晶状体纤维内都广泛存在着泛素－蛋白酶体系统[10]，能够有效地减少氧自由基造成的损伤，对晶状体具有保护作用，因此蛋白酶体对维持晶状体的透明性发挥着重要的作用，而蛋白酶体功能损伤与白内障形成密切相关。有研究表明人晶状体内蛋白酶体的三种酶活性随年龄增加都逐渐减低[11]，而在白内障晶体内蛋白酶体三种酶的活性较正常晶体内的蛋白酶体活性均明显降低[12]，白内障晶体的混浊程度也与蛋白酶体酶活性降低的程度明显相关。在氧化环境下，晶状体上皮细胞内蛋白酶体的活性明显受到抑制。由此我们推测，氧自由基造成的损伤抑制了蛋白酶体的保护功能，从而导致了白内障的形成，如果人为提高晶状体内蛋白酶体的功能，就可以增强晶状体防御氧化损伤的能力，从而延缓白内障的形成。

    本研究构建了含有蛋白酶体PSMB5亚单位的重组真核表达质粒pcDNA3.1-PSMB5，并将其转染人晶状体上皮细胞系SRA01/04后，获得G418抗性细胞克隆，并采用RT-PCR及Western blot两种方法检测证实我们成功的使人晶状体上皮细胞系SRA01/04过表达PSMB5分子。本实验还检测了在H2O2处理的氧化环境下晶状体上皮细胞增殖能力的变化。研究结果提示，转染的晶状体上皮细胞和空载体转染的晶状体上皮细胞两组细胞的增殖能力逐渐下降，但是空载体转染细胞增殖能力受抑制程度更为明显。这表明PSMB5具有一定的抗氧化能力，对晶状体上皮细胞有保护作用。

    本实验在体外成功模拟了晶状体上皮细胞中蛋白酶体PSMB5过表达，使蛋白酶体功能维持较高水平的状态，为研究氧化环境下蛋白酶体对晶状体上皮细胞的影响及其作用机制提供了良好的体外模型，并为深入研究蛋白酶体在年龄相关性白内障形成过程中的作用机制奠定了基础。

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