【摘要】 目的 探讨基质金属蛋白酶14（matrix metalloproteinase14,MMP14）和细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN）在视网膜母细胞瘤（retinoblastoma, Rb）中的表达及其与临床病程的关系。方法 用免疫组织化学SP法分别检测39例Rb中MMP14及EMMPRIN的表达；用LEICA IM 50型全自动医学图像分析系统测量其平均灰度值，比较不同临床和病理阶段Rb中表达MMP14和EMMPRIN的差异及二者阳性表达之间的关系。结果 39例Rb中MMP14阳性表达34例，占87.18%；EMMPRIN阳性表达33例，占84.62%；青光眼期Rb中MMP14和EMMPRIN的表达明显高于眼内期（P＜0.01及P＜0.05），眼外期二者表达明显高于青光眼期（P＜0.01及P＜0.05）；视神经浸润组Rb中MMP14和EMMPRIN的表达明显高于无视神经浸润组（P＜0.01及P＜0.05）；Rb中MMP14和EMMPRIN的阳性表达水平呈密切相关（P＜0.01）。结论 MMP14及EMMPRIN的表达水平可能与Rb的浸润转移有关，二者共同促进Rb的浸润转移。
【关键词】 视网膜母细胞瘤；基质金属蛋白酶14；细胞外基质金属蛋白酶诱导因子；免疫组织化学
To investigate the expressions of matrix metalloproteinase14 (MMP14) and extracellular matrix metalloproteinase inducer (EMMPRIN) in retinoblastoma(Rb) and the relationships between MMP14 and EMMPRIN and tumor development. Methods Immunohistochemical technique was used to determine the expressions of MMP14 and EMMPRIN in 39 cases of paraffin embedded Rb samples. Quantitative analysis of the expressions of MMP14 and EMMPRIN were assessed by measuring the mean gray scale of Rb tissue with the LEICA IM 50 Color Pathologic Analysis System. Differences of the expressions of MMP14 and EMMPRIN in each clinical and pathological stage were statistically analyzed, and the same step was also undertaken to study the relationship between Rb with MMP14 positive expression and that with EMMPRIN positive expression. Results Positive expression rate of MMP14 was 87.18% (34/39) and of EMMPRIN was 84.62%(33/39). The expressions of MMP14 and EMMPRIN were significantly higher in tumors of the glaucomatous stage than those in the intraocular stage (P＜0.01 and P＜0.05), and the same conclusion can be concluded between those in the extraocular stage and those in the glaucomatous stage (P＜0.01 and P＜0.05), also the expressions of MMP14 and EMMPRIN were significantly higher in tumors with optic nerve invasion than those without optic nerve invasion (P＜0.01 and P＜0.05). There was a statistically significant positive correlation between the
视网膜母细胞瘤（retinoblastoma,Rb）起源于视网膜胚胎性核层细胞，是一种婴幼儿最常见的、危害性最大的眼内恶性肿瘤，可危及患儿的视力甚至生命。通常认为，Rb患儿的预后与视神经浸润与否、有无眶内及远处转移有密切关系。近年来的研究显示基质金属蛋白酶14（matrix metalloproteinase14,MMP14）以及细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN）在促进肿瘤的侵袭转移中发挥着重要作用［1］。本研究运用免疫组织化学法检测了MMP14和EMMPRIN在视网膜母细胞瘤中的表达，分析其与临床病程的关系，探讨其在肿瘤浸润转移中的意义。
1 资料与方法
1.1 病历资料
本实验所有石蜡包埋标本均来自山东省立医院眼科病理室自1988年～2005年间接受眼球摘除术的Rb患者，共39例，其中男16例，女23例。年龄3月～8岁，平均2.9岁。通过调阅病历及病理诊断书确定临床分期：眼内期22例，青光眼期11例，眼外扩展期6例，全身转移期0例；有视神经浸润18例，无视神经浸润21例；双眼发病1例。所有病例均经病理确诊。
1.2 主要试剂
兔抗人MMP14单克隆抗体，工作浓度为1∶100；兔抗人EMMPRIN单克隆抗体，工作浓度为1∶100，即用型SABC免疫组化染色试剂盒（包括生物素化羊抗兔IgG二抗、DAB显色剂、SABC），中性树胶均购自武汉博士德公司。
1.3 实验方法
采用免疫组织化学法。具体步骤：石蜡标本行4?μm厚连续切片，脱蜡，梯度乙醇脱水，3%过氧化氢乙醇溶液孵育10?min,以灭活内源性过氧化氢酶,蒸馏水洗涤10?min；枸橼酸盐缓冲液内微波修复抗原，92?℃～98?℃,10?min，室温冷却，PBS洗涤3次；滴加5％BSA封闭液，室温20?min，不洗；滴加一抗（用PBS代替一抗为阴性对照），4?℃湿盒过夜，PBS洗涤3次；滴加二抗工作液，37?℃湿盒内孵育20?min，PBS洗涤3次；滴加试剂SABC，37?℃ 10?min，PBS洗涤4次；DAB显色,光镜下控制，观察染色结果满意后水洗终止,苏木素复染细胞核，二甲苯透明,梯度乙醇脱水。自然晾干后中性树胶封片。
1.4 观察方法
光学显微镜下观察，Rb切片组织中胞浆和/或胞膜上出现较多棕黄色颗粒为阳性表达，无棕黄色颗粒出现为阴性表达。并在LEICA IM 50型全自动医学图象分析系统的10×40倍光镜下测量每张切片Rb组织的灰度值，每张切片随机选取5个视野，算出其平均值为每张切片的灰度值。灰度值愈小其阳性表达水平愈高,反之则表达水平愈低。
1.5 统计学处理
结果采用SPSS 13.0统计软件包进行两样本t检验、方差分析、最小显著差检验以及Spearman等级相关检验。
2 结 果
2.1 MMP14和EMMPRIN在Rb中的表达
39例Rb标本中，检测到MMP14阳性表达34例，表达率为87.18%（34/39）；EMMPRIN阳性表达33例，表达率为84.62%（33/39），二者皆表现为胞浆和/或胞膜呈现出棕黄色着色（图1、2）。经两样本t检验，MMP14阳性组与阴性组中Rb组织的灰度值差异具有统计学意义（P＜0.01），EMMPRIN阳性组与阴性组中Rb组织的灰度值差异也具有统计学意义（P＜0.01），见表1（略）。图3为阴性对照。
2.2 MMP14和EMMPRIN在Rb有视神经浸润和无视神经浸润组中的表达
39例Rb标本中，有视神经浸润者18例（46.15%），无视神经浸润者21例（53.85%）。经两样本t检验，MMP14在有视神经浸润组和无视神经浸润组中表达的灰度值差异具有统计学意义（P＜0.01），EMMPRIN在有视神经浸润组和无视神经浸润组中表达的灰度值差异也具有统计学意义（P＜0.05），见表2（略）。
2.3 MMP14和EMMPRIN在Rb临床各期中的表达
39例Rb中，眼内期22例，青光眼期11例，眼外扩展期6例。经方差分析，认为MMP14在眼内期、青光眼期及眼外扩展期表达水平不等或不全相等（F=18.572，P＜0.01），EMMPRIN在眼内期、青光眼期及眼外扩展期表达水平不等或不全相等（F=10.772，P＜0.01）。进一步经最小显著差检验进行各组间均数的两两比较发现，MMP14或EMMPRIN在眼内期与青光眼期及眼外扩展期、青光眼期与眼外扩展期之间的表达差异具有统计学意义，见表3。
2.4 MMP14和EMMPRIN在Rb中表达水平的关系对MMP14和EMMPRIN在Rb中的表达水平进行Spearman等级相关分析，Rb组织中EMMPRIN与MMP14的表达强度呈正相关关系(r=0.877, P＜0.01)。
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