作者：盛艳梅 孟宪丽 张艺 龙怡
【摘要】目的 考察灯盏花素对体外高压诱导的视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)凋亡的影响，探讨灯盏细辛视神经保护作用的物质基础。方法 用胰酶消化法将20只出生2～3 d的SD（Sprague-Dawley）乳鼠视网膜制成细胞悬液，接种于经多聚鸟氨酸（HA）和层粘连蛋白（LN）包被的血盖片中。培养72 h后，将覆有细胞的血盖片转入加压装置中，加入灯盏花素溶液，继续培养24、48 h，采用Caspase-3蛋白免疫组化染色法及原位末端脱氧核苷酸转移酶标记(Tunel-POD)法进行检测，每天观察细胞形态，同时对部分细胞行NSE染色检查。结果 细胞生长良好，NSE染色表明，85%以上的细胞为RGCs。给药组的Caspase-3蛋白阳性表达指数和凋亡指数均明显低于模型组（P＜0.05，Ｐ＜0.01）。结论 灯盏花素能对抗压力诱导的RGCs凋亡，为灯盏细辛视神经保护的有效组分。
【关键词】 灯盏花素；视网膜神经节细胞培养；高眼压模型；细胞凋亡
Abstract：Objective To investigate the effects of Breviscapine on apoptosis of retinal ganglion cells by high intraocular pressure in vitro and explore the substantial foundation with neuroprotective effects in glaucoma of E.breviscapus.Methods The retinal of 20 post-natal 2-3 days Sprague-Dawley rats were dissociated into cell suspension with trypsin digestion.The cell suspension was implated in 6-well culture plates covered with hyaluronic acid and laminin in each well.After culturing for 72 hours，glass cover were putted into the high intraocular pressure device and the Breviscapine were added to the dyeing vats,continue to culture 24/48 hours.Observing the expression of Caspase-3 protein by the immuneohistochemistry method and apoptotic cells were detected by TUNEL-POD method.And some of the 5-day culture cells were identified by NSE technique.Results The cells grew very well，over 85 percent of the living cells were retinal ganglion cells by NSE identification.The positive myocytes of Caspase-3 protein and the apoptosis index in the experiment were significantly lower than those in the model group(P＜0.05,Ｐ＜0.01).Conclusions Breviscapine can protect retinal ganglion cells against apoptosis by high intraocular pressure，Which is the main active component of E.breviscapus with neuroprotective effects.
Key words:Breviscapine；retinal ganglion cells culture；high intraocular pressure model；apoptosis
视网膜神经节细胞凋亡（retinal ganglion cells，RGCs）是视神经损伤的共同通路，目前尚缺乏防止RGCs的有效药物。灯盏细辛［Erigeron breviscapus(Vant.)Hand.- Mazz.］主要含有以灯盏花素为主的黄酮类、香豆素类等化合物［1］。研究证实其有减少血管外周阻力，改善大脑微循环及抗血小板聚集的作用［2］。随着对其药理作用的深入研究，其应用范围正在拓展。实验发现它在青光眼治疗方面可以通过多种途径起到视神经保护作用［3～4］。作者对胡竹林［5］、段永恒［6］使用的培养瓶注气式加压装置加以改进,建立了更加科学合理的体外高眼压模型。并在考察了灯盏细辛多组分对常压下RGCs存活的基础上，用该模型进一步考察了其中灯盏花素对体外高压诱导的RGCs的影响，以明确其起视神经保护作用的物质基础，为开发研制理想的青光眼视神经保护剂提供参考。
1 材料
1.1 实验动物
SD乳鼠（出生2～3 d内），♀♂兼用。由成都中医药大学实验动物中心提供，合格证号：川实动管第11号。
1.2 药品及试剂
灯盏花素原料药，购于云南玉溪万方天然药物有限公司，批号：040501；尼莫地平注射液0.2mg·ml-1,德国拜耳公司，批准文号：国药准字J20020102；多聚鸟氨酸（Sigma公司，P-2533），层粘连蛋白（Roche公司，批号：1243217），胰蛋白酶（Gibco公司，批号：1118374），胎牛血清(Gibco公司，批号：1216472)，小牛血清(成都哈里生物有限公司，批号：20040125)，DMEM高糖培养基(Sigma公司，批号：1242226)，5-溴-2′-脱氧脲苷(Brdu，武汉博士德有限公司，批号：90139520)。
1.3主要仪器
DMIL莱卡倒置相差显微镜，CO2孵箱（SANYO MCO-15AC），奥林巴斯体式显微镜等。
1.4 统计学方法
实验数据采用单因素方差分析，应用SPSS 12.0 统计软件进行处理。
2 方法
2.1 培养板的处理
取 6 孔板，于每孔预先置入一血盖片(24 mm×24 mm)，加入0.2 mg·ml-1多聚鸟氨酸1 ml，振荡均匀，室温静置2 h后，吸弃上清液，用适量PBS液洗涤三次，加入5 μg·ml-1层粘连蛋白2 ml，置37℃，5％的CO2孵箱中过夜，备用。
2.2 细胞悬液制备及接种培养
将乳鼠无菌条件下断颈处死摘取眼球，在体式显微镜下沿角膜剪开,钝性分离出视网膜组织。用0.125%的胰蛋白酶37℃下消化，30 min后加入纯小牛血清终止消化，用无菌钢筛网滤过。将滤液1 000 r·min-1离心5 min，弃上清液。加入完全培养液，吸管吹打使之制成单细胞悬液。计数并调整细胞密度为1ml含5×106个细胞。将细胞悬液按每孔1 ml接种于经包被的6孔板中，培养24 h后加入5-溴-2′-脱氧脲苷以抑制非神经细胞生长。
2.3 高眼压模型制作及药物的加入
培养 72 h 后，将覆有细胞的血盖片嵌入到自制玻璃槽内，随机分成每槽6张，各槽内含不同受试药（灯盏花素、尼莫地平用无血清培养液配制）的完全培养液25 ml，模型对照组加入等体积的培养液。然后按自行设计的加压装置进行培养，使压力达到10.64 kPa。另设正常对照组（压力为0），保持24 h后作Caspase-3蛋白免疫组化检测，48 h后进行凋亡检测。
[1] [2] 下一页 |
