2.4  形态学观察

    应用倒置相差显微镜每天观察细胞形态及生长情况。

    2.5  RGCs鉴定［7］

    终止培养后，取两张覆有细胞的血盖片做抗神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫组化染色检查。

    2.6  Caspase-3蛋白免疫组化染色检测

    采用链霉素-生物素复合物（ABC）技术进行检测。血盖片用 90%乙醇固定10 min，PBS洗三次，每次2 min。迈新S-P试剂盒（羊抗兔鼠）A清除非特异性物质阻断过氧化物酶活性，37℃孵育10 min。迈新S-P试剂盒B血清封闭，37℃孵育10 min，沥去血清，滴加标记一抗Caspase-3 37℃孵育60 min。沥去PBS，加生物素标记二抗（IgG）迈新试剂C，37℃孵育10 min。沥去PBS，加链霉菌抗生物素—过氧化物酶溶液，迈新试剂D，37℃孵育10 min 。沥去PBS，新配制的显色剂DAB，显色3～5 min。以上每步之间均用PBS漂洗三次，每次5 min。采用阳性表达指数（高倍镜下，阳性细胞占同一视野细胞总数的百分比表示）作为阳性表达的定量指标，每张血盖片随机选5个阳性表达明显的视野，求其平均值。

    2.7  原位末端脱氧核苷酸转移酶标记法

    采用TUNEL-POD法进行检测。血盖片用90%乙醇固定30 min，风干。通透处理用0.1% TritonX-100,室温孵育10 min。PBS冲洗2次，搽干样品周围的水，滴加50 μl 的TUNEL 反应混合液，湿盒中37℃孵育60 min。0.3%H2O2：甲醇液，室温孵育2 min。加入50 μl转化剂-POD，湿盒中37℃孵育30 min。加入50 μl DAB底物溶液，室温孵育10 min致凋亡细胞棕黄色出现。以上每步之间均用PBS漂洗三次，每次5 min。采用凋亡指数（计算同阳性表达指数）作为细胞凋亡的定量指标。

    3  结果

    3.1  形态学观察

    视网膜神经细胞培养2～4 h开始贴壁，24 h后细胞呈圆形或椭圆形，部分细胞有聚集现象，多数细胞已经开始伸出短而小的突起，见图1。加入5-溴-2′-脱氧脲苷后见少量细胞溶解坏死。48 h后细胞体积增大，突起伸长，且突起之间相互连接成网状。72 h后细胞突起生长达到峰值，长度为胞体的数倍，见图2。5d后细胞总数开始减少。加压固定48 h后模型组与正常对照组比较，可见细胞胞体缩小，核固缩，甚至出现空泡样改变，见图3、4。

    3.2  RGCs鉴定

    85%以上圆形细胞及其细长突起抗NSE染色阳性,可确认为RGC。

    3.3  视网膜神经细胞中Caspase-3蛋白表达变化

    显微镜下可见胞浆呈棕黄色的Caspase-3蛋白阳性表达细胞，其阳性细胞表达指数统计结果见表1。结果表明,与模型对照组比较，灯盏花素与阳性药均能明显抑制视网膜神经节细胞中Caspase-3蛋白的表达（P＜0.05,P＜0.01）。

    3.4  视网膜神经节细胞凋亡情况

    显微镜下可见胞核被染成棕黄色的凋亡细胞，各实验组对视网膜神经节细胞凋亡指数的影响，见表2。结果表明,与模型对照组比较，灯盏花素及阳性药均能明显对抗体外高压诱导的RGCs凋亡（P＜0.05）。表1  各组对Caspase-3蛋白阳性表达指数的影响表2  各组对视网膜神经节细胞凋亡指数的影响

    4  讨论

    常用的实验性高眼压动物模型虽能较好的模拟青光眼高眼压环境，真实的反映压力对RGCs的影响，但无法对RGCs在压力作用下的生长情况进行全程观察。而采用RGCs体外加压培养的方法就能够解决这些问题。目前国内外常用的加压培养装置多为注液式加压，容易造成缺氧或增加污染机会。本实验采用的自行设计的加压培养装置是在前人基础上加以改进而成的。该装置加压操作方便、可行；在不需要同时监测几十个培养瓶，减少工作量的同时，还可以节约大量的培养及检测试剂，减少细胞用量，从而大大降低了实验成本；同时可以监测压力，保证了更多的样本可以在相同环境下造模，尽量减少了实验误差。采用该培养模型混合培养RGCs，不仅有利于视网膜神经节细胞生长，而且用它进行RGCs损伤研究，更接近于整体条件下的反应情况。

    本实验在建立视网膜神经节细胞体外加压培养体系的基础上，考察了灯盏细辛对压力诱导的RGCs凋亡的影响，并明确了其起效成分。其中灯盏花素原料药为含灯盏乙素达85%以上的粗提取物，实验中还发现当灯盏花素浓度（0.125 mg.ml-1）为灯盏细辛总黄酮浓度（10 mg.ml-1）的近八十分之一时仍呈现出相似的药理活性，说明分离有效成分能提高药效和减少用药量。

    由于压力对体外培养的RGCs的影响还鲜有文献报道，尤其是关于药物对压力诱导细胞凋亡的保护更是罕见报道，将改进后的这种高眼压模型应用于细胞水平的药物筛选将具有重要意义。

    【参考文献】

    ［1］张卫东，陈万生，王永红，等.灯盏花黄酮苷化学成分的研究［J］.中草药，2000，31（8）：565－566.

    ［2］吕琳，金毅，朱宇明，等.灯盏细辛的研究进展［J］.中草药，1996，27卷增刊：238－240.

    ［3］朱益华，蒋幼芹，刘忠浩，等.灯盏细辛注射液对鼠实验性高眼压视神经轴浆运输的影响［J］.中华眼科杂志，2000；36（4）：289－291.

    ［4］朱益华，蒋幼芹，刘忠浩，等.灯盏细辛对高眼压鼠视网膜神经节细胞超微结构的影响［J］.湖南中医杂志，2000；16（3）：71－72.

    ［5］胡竹林，杜蜀华，胡正.压力对大鼠纯化视网膜神经节细胞中Fas/FasLmRNA表达的影响［J］.眼科新进展，2002，22（6）：380－384.

    ［6］段永恒，原慧萍，王莉娜.压力对视网膜神经节细胞存活及突起生长影响的研究［J］.哈尔滨医科大学学报，2004，38（1）：33－36.

    ［7］杨瑞华，陈景元，邓中荣，等.猪视网膜神经节细胞的培养及超微结构［J］.第四军医大学学报，2001，22（12）：1092－1094.

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