2结果

    2.1原代周细胞的生长状况 用胶原酶消化视网膜血管后分离周细胞，在倒置相差显微镜下观察见大多为单个圆形细胞，大小均一，中央有一圆形不透光区域为细胞核。2wk后大部分细胞贴壁变扁平，成多角形态，伸出较多突起，并逐渐形成集落生长。3wk后，细胞铺满，致密排列，重叠多层（图1A）。传代后周细胞在4h内开始贴壁（图1B），细胞由圆形伸展为多角形，大多呈多角形，伸出较多突起。3～4d后细胞融合成密集的单层细胞，排列成不规则栅栏状。1wk后，细胞铺满，致密排列，重叠多层（图1C）。

   2.2 周细胞的鉴定和增殖 ATIN免疫组织化学染色显示周细胞胞质内不着色。Ⅷ因子抗体免疫组织化学染色显示周细胞胞质内特异性蓝紫色着色。阳性率为100%（图1D）。 采用该方法获得的PC均能传代培养。而且，传代培养后细胞增殖速度均较原代培养时明显增快，4～5d即进入对数生长期,直到9～10d才进入平台期(图2)。

    图 1 A 周细胞原代，图中黑色团块为死亡的杂细胞 200× ；B 接种4小时的周细胞第二代，周细胞开始贴壁、变形 400× ；C 融合的周细胞第二代 200×；D 周细胞鉴定

    图2 视网膜毛细血管周细胞生长曲线（MTT法）

    3讨论

    视网膜毛细血管周细胞的分离和纯化是一个较为复杂的操作过程，以往多采用匀浆、逐级过滤、消化分离法[3,4]，我们经过改进，用Ⅲ型胶原酶消化40min后，仅用120μm的尼龙筛过滤1次除杂。经鉴定，在周细胞分离、培养过程中既未发现内皮细胞的掺杂，也未见平滑肌细胞的生长。我们成功的建立了分离和培养视网膜毛细血管周细胞的有效方法。在周细胞的体外培养实验中获取纯净的周细胞是实验的关键所在[5]。在PC细胞取材时，若操作不慎极易混进成纤维细胞、视网膜色素上皮细胞和其它杂细胞。成纤维细胞分裂增殖较快，少量成纤维细胞混入即可成为优势细胞，抑制周细胞的分裂增殖；若混入较多红细胞，分裂增殖快的红细胞也会影响周细胞的分裂增殖，甚至使周细胞全部死亡，使实验无法进行。要保证周细胞的纯度，应注意：牛眼取下后及时在750g/L酒精中浸泡2min，可使视网膜容易剥脱，避免混入视网膜色素上皮细胞及成纤维细胞；剖开眼球的位置应在角巩膜缘后3mm处，视网膜将随玻璃体的脱出完整剥离；我们还发现，胶原酶消化时间越长，内皮细胞及平滑肌细胞等杂质细胞污染越多，周细胞活力越下降，因此，以4倍体积的胶原酶Ⅲ消化40~60min为宜。消化后一定要用120μm的尼龙筛过滤1次，以除去杂细胞和组织碎片。我们用庆大霉素代替Betadine对实验眼球进行消毒，效果良好，未发现毒副作用，而且庆大霉素较Betadine易得，价廉，为视网膜毛细血管周细胞的培养提供了极大的方便。

    DMEM含有丰富的维生素、氨基酸，各种营养成分比例适当，适合细胞生长需要，而广泛应用于细胞培养。在配置DMEM培养液时应注意将pH值调至7.0±，微孔滤膜过滤后pH值将升高0.2～0.4，使培养液的最终pH值为7.2～7.4。为保持pH值的稳定，在培养液中加入适量HEPES。原代培养宜选用胎牛血清，浓度为200ml/L，胎牛血清中含有促细胞贴壁的成分，有助于周细胞贴壁生长。在细胞已适应体外培养环境后，传代培养可选用小牛血清（nenwbom calfserum,NCS），浓度为100～200ml/L。

    【参考文献】

    1李秀钧.糖尿病研究进展-第16届国际糖尿病联盟大会纪要.中华内分泌代谢杂志,1998;14(2):72-74

    2 Gillies MC, Tao S. High glucose inhibits retinal capillary pericyte contractility in vitro. Invest Ophthalmol Vis Sci ,1993;34:3396-3399

    3 Burney SM, Massicotte SJ, Heru N. Rrtinal vascular endothelial cells and pericytes: differential growth characteristics in vitro . Invest Ophthalmol Vis Sci ,1983;24:470-480

    4 Gitlin JD, Patricia A. Culture of retinal cells using selective growth media. Micro VAX Res ,1983;26:74-80

    5赵平,于华军.基质金属蛋白酶及其组织抑制剂在糖尿病小鼠视网膜组织中的表达.国际眼科杂志,2004;4(4):610-614

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