作者：王辉　刘哲丽　郝旭红　徐丽 

    【摘要】目的: 检测增生性玻璃体视网膜病变（PVR）视网膜前膜和视网膜色素上皮（RPE）细胞中组织型转谷氨酰胺酶(tTG)的表达情况，探讨tTG是否参与PVR的发病过程。方法: PVR患者21例,收集视网膜前膜，C级8例，D级13例, 行tTG免疫组织化学染色。另对培养3～5代的人RPE细胞分别用含有100mL/L PVR玻璃体液、正常玻璃体液和PBS的DMEM培养液进行孵育24h后行tTG免疫细胞化学染色。光镜下观察，比较C级和D级膜的表达阳性率，显微图像分析测量3组RPE细胞染色的平均灰度值。结果：在PVR视网膜前膜中tTG呈阳性表达（81％）， C级和D级膜表达阳性率无差异（C级88％，D级77％，P >0.05）。培养的人RPE细胞表达tTG，在PVR患者的玻璃体液作用下，tTG表达的平均灰度值为137.0±2.6，与正常玻璃体液组（143.5±2.9）及PBS对照组（143.6±3.0）相比，表达水平升高（P <0.05）。结论：PVR视网膜前膜和培养的人RPE细胞tTG表达阳性，在PVR患者的玻璃体液作用下，RPE细胞的tTG表达水平升高，这表明tTG参与了PVR的发病过程，在PVR视网膜前膜的形成过程中可能有重要作用。

    【关键词】  增生性玻璃体视网膜病变　组织型转谷氨酰胺酶　视网膜色素上皮细胞

    Tissue transglutaminase in proliferative vitreoretinopathy

    Abstract AIM: To investigate the expression of tissue transglutaminase (tTG) in proliferative vitreoretinopathy (PVR) epiretinal membranes and retinal pigment epithelium (RPE) cells which is thought to be a key element in PVR formation. METHODS: Twenty-one samples of epiretinal membranes were obtained from patients with PVR involved previous rhegmatogenous retinal detachment. Eight samples were at C stage of PVR, 13 samples were at D stage. The samples were selected to perform immunohistochemical staining. Third- to fifth-passage human RPE cells were incubated by serum-free DMEM containing 100mL/L PVR vitreous samples, normal vitreous samples or PBS and stained immunocytochemically. Positive rates of expression were calculated in both C and D stage membranes under light microscopy. The staining average gray values of the three group RPE cells were detected with image analyzing system. RESULTS: The expression of tTG was present in PVR epiretinal membranes (80%). Positive staining was most prominent in ECM, fibroblast-like cells and macrophages. There was no significant difference in positive rates between C and D stage membranes (P >0.05). Cultured human RPE cells expressed tTG, and the expression level of RPE cells incubated with PVR vitreous samples was higher than those incubated with normal vitreous samples and PBS (P <0.05). CONCLUSION: The findings demonstrated that tTG is present in PVR epiretinal membranes and cultured human RPE cells. Its amount is stimulated to increase by the PVR vitreous humor. tTG takes part in the process of PVR. It may play an important role in the formation of PVR membranes.

    · KEYWORDS:proliferative vitreoretinopathy; tissue transglutaminase; retinal pigment epithelium

    0引言

    增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy，PVR）是孔源性视网膜脱离或视网膜脱离复位术后常见的并发症，是眼科治疗中的难题之一，其具体的发病机制目前还不明确。PVR的病理过程主要包括视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞移行和增生，并分泌细胞外基质（extracellular matrix，ECM），ECM在局部沉积下来，为RPE细胞提供支架结构，同时进一步调控细胞的增生和分化，从而在玻璃体内和视网膜前和后表面形成广泛的纤维细胞增生膜，这些膜能收缩并牵拉视网膜引起复杂性视网膜脱离，导致视网膜结构和功能的破坏[1]。因此，RPE细胞的增生和ECM的沉积无疑是PVR发生发展过程中两个最为关键的环节。

    近年来的研究表明，基质降解酶类如基质金属蛋白酶等在PVR增生膜的发展过程中释放增加[2]。这些酶的主要功能是降解ECM蛋白，防止过量的ECM沉积。不过尽管有这些降解酶存在，ECM仍持续积聚 [3]。因此，在此过程中一定同时存在稳定ECM使之不能被降解的因素，如果能找到这个因素并加以研究，可能会找到避免ECM沉积从而阻止PVR发展的方法。组织型转谷氨酰胺酶（tissue transglutaminase，tTG）又称转谷氨酰胺酶Ⅱ型（transglutaminaseⅡ，TGⅡ），属于转谷氨酰胺酶家族。它的主要功能是催化ECM成分之间形成共价交联，这种交联非常稳定，不能被任何已知的存在于脊椎动物体内的酶所降解[4]，因此PVR增生膜中ECM的持续积聚可能与tTG催化的这种交联反应有关。我们检测人PVR视网膜前膜和培养的人RPE细胞中tTG的表达情况，以及PVR患者的玻璃体液对RPE细胞的tTG表达水平的影响，探讨tTG是否在PVR的发病过程中发挥作用，以进一步明确PVR的发病机制，为寻找新的治疗方法提供依据。

    1材料和方法

    1.1材料 收集孔源性视网膜脱离合并PVR患者21例的视网膜前表面增生膜，C级8例，D级13例，多聚甲醛中固定，4℃冰箱冷藏备用。取死亡12h内，角膜移植术后的正常供体眼球6例，采用胰蛋白酶消化法获得人RPE细胞进行传代培养[5,6]，采用免疫细胞化学染色检测细胞角蛋白的方法对所用RPE细胞进行鉴定。抽取PVR患者的玻璃体液15例和角膜移植术后供体眼球的正常玻璃体液6例，1 000r/min离心8min，取上清液置于－70℃保存备用。鼠抗人tTG mAb和免疫组化超敏SP试剂盒等购自福州迈新生物技术开发公司。

    1.2方法 PVR视网膜前膜固定后常规制作石蜡切片，先行HE染色，结构完整者行免疫组织化学染色。培养3～5代的人RPE细胞接种于盖玻片表面并平均分为3组，分别用含有100mL/L PVR玻璃体液、正常玻璃体液和PBS的DMEM培养液培养3组细胞，固定后行免疫细胞化学染色。光镜下观察tTG的表达和分布，以背景清晰、细胞内出现棕黄色着色为阳性。计算C级和D级膜的表达阳性率，并采用MetaMorph/DP10/BX41显微图像分析系统测量3组RPE细胞片染色的平均灰度值。

    统计学处理：采用χ2检验比较C级和D级膜表达tTG的阳性率，单因素方差分析比较3组不同培养条件的RPE细胞中tTG表达的平均灰度值，P <0.05被认为差别有统计学意义。所有统计学分析均使用SPSS12.0统计软件来完成。

    2结果

    2.1 PVR视网膜前膜 结构完整的前膜中可见数量不等的RPE细胞、成纤维细胞样细胞、神经胶质细胞、巨噬细胞、淋巴细胞，排列不规则，还可见到胶原纤维等细胞外基质成分。C级膜中，细胞成分较多，细胞外基质相对较少，D级膜则相反。tTG的棕黄色阳性表达存在于细胞外基质和一些细胞的胞质。在细胞外基质中，阳性染色呈不规则灶性分布。阳性细胞主要为成纤维细胞样细胞和巨噬细胞，呈散在或聚集分布（图1A，B）。自身阴性对照组均未见阳性染色。8例C级膜中7例染色阳性（88％），13例D级膜中10例染色阳性（77％），行χ2检验，由Fisher确切检验法得P =1.00，故二组阳性表达率无统计学差异。

    2.2培养的人RPE细胞 第3代以后的RPE细胞内色素颗粒明显减少至消失，细胞形状近似于成纤维细胞样。tTG阳性表达的RPE细胞表现为细胞质中浓淡不一的棕黄色染色。PBS对照组和正常玻璃体液组中可见散在细胞呈tTG阳性表达（图2A，B）；PVR玻璃体液组中阳性细胞明显增多，且染色呈浓密的深棕色，染色阴性的细胞少见（图2C）。不加第一抗体的自身阴性对照组中细胞均无着色。PVR玻璃体液组tTG表达的平均灰度值为137.0±2.6，正常玻璃体液组tTG表达的平均灰度值为143.5±2.9，PBS对照组tTG表达的平均灰度值为143.6±3.0。对三组结果进行单因素方差分析，F＝31.91，P <0.05，各组均数之间有显著性差异。进一步行各组结果之间的两两比较，PVR玻璃体液组tTG的表达水平高于正常玻璃体液组和PBS对照组，差别有统计学意义（P <0.05）；正常玻璃体液组与PBS对照组的表达水平无统计学差异（P >0.05）。

    图 1 PVR视网膜前膜tTG表达（SP×400）A：C级；B：D级

    图 2 培养的RPE细胞的tTG染色（SP×400）A：PBS对照组；B：正常玻璃体液组；C：PVR玻璃体液组

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