作者：宋哲 黎晓新 于文贞 董建强 闫征
【摘要】目的：研究腺伴随病毒载体介导Kringle5基因对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUC)及视网膜神经细胞影响作用。方法：亚克隆构建pSNAV-Kringle5-gfp载体，腺伴随病毒包装形成rAAV-Kringle5-gfp；HUC培养及SD大鼠视网膜神经细胞培养；按设计分为试验组、阴性对照组和空白对照组；聚合酶链反应(PCR), MTT法对各组进行细胞活力测定；荧光显微镜照相。 结果：腺伴随病毒载体介导Kringle5基因产生Kringle5物质对HUC有抑制作用，实验组与对照组比较P <0.01，实验组与空白对照组比较P >0.05；腺伴随病毒载体介导Kringle5基因产生Kringle5物质对SD大鼠视网膜神经细胞实验组和空白对照组没有影响，实验组与对照组及实验组与空白对照组比较P >0.05。结论：腺伴随病毒载体介导Kringle5基因能够对新生血管有抑制作用而对视网膜神经细胞无不良影响作用。
【关键词】 腺伴随病毒载体 血管抑制素Kringle5 血管内皮细胞 SD大鼠视网膜神经细胞
Adeno-associated virus type-2 expression of Kringle5 effect on HUC and Retinal cell of SD rat
AbstractAIM: To investigate the effect of recombinant adeno-associated virus vector expressing human Kringle5 on the HUC(Human Umbilical Vein Endothelial Cells) and the retina nerve cell of SD rats. METHODS: The human kringle5 cDNA was plugged into expression vector of pSNAV to construct the plasmid pSNAV-Kringle5-gfp. HUC and the retina nerve cell of SD rats were cultured. All the samples were devided into three groups: experimental group, negative control group and blank control group. Polymerase chain reaction (PCR), MTT assay and fluorescence microscopy were applied.RESULTS: rAAV-Kringle5 produced kringle5, which inhibits the HUC (P <0.01 between experimental group and controls; P>0.05 between experimental group and blank control) but has no effect on the retinal nerve cell of rats (P <0.01 between experimental group and controls; P <0.05 between experimental group and blank control).· CONCLUSION: The method of producing kringle5 by recombinant adeno-associated virus can be used to inhibit retina angiogenesis with no effect on retinal nerve cells.
· KEYWORDS: adeno-associated virus vector; Kringle5; HUC; retinal nerve cells
0引言
纤维溶酶原Kringle5片断能够抑制肿瘤的生长，对新生血管形成具有极强抑制作用，是目前发现抑制新生血管作用最强的抑制剂[1]。在眼科方面，国内外文献曾报道用Kringle5制剂治疗新生血管如脉络膜新生血管，视网膜新生血管，角膜新生血管等报道[2-4]。Kringle5是纤维溶酶原片段,由80个氨基酸组成[1,5]，它的获得主要是通过提取纤维溶酶原裂解获得,但是获取量有限且工艺复杂。理想的方案是利用基因重组技术将其在生物体内长期表达达到治疗新生血管目的。2型腺伴随病毒具有对人体不致病，能感染分裂和非分裂期细胞等优点，在此基础上改建得到的重组腺伴随病毒载体是较理想的基因转移载体[6]。在本实验中，我们利用腺伴随病毒载体介导Kringle5基因,观察其对视网膜神经细胞和血管内皮细胞是否有作用，为下一步动物实验提供实验依据。
1材料和方法
1.1材料 含Kringle5基因的质粒pSECTAG- Kringle5由北京大学人民医院眼科中心提供；腺伴随病毒载体pSNAV购自本元正阳基因公司，为带有腺相关病毒末端反向重复序列的真核表达载体，含CMV启动子、AMP抗性及G418抗性并含有KpnI和XbaI等多克隆位点及GFP基因；限制性内切酶；T4DNA连接酶；M-MLV逆转录酶购自华美公司；HUC购自中国预防科学院病毒所；DMEM培养基购自Gibco公司；SD大鼠视网膜神经细胞由新生SD幼鼠视网膜经过消化所得。
1.2方法 pSNAV-Kringle5 重组腺伴随病毒载体构建和鉴定：Kringle5及其信号肽由pSECTAG-Kringle5载体克隆至pSNAV形成pSNAV-Kringle5。根据pSECTAG-Kringle5[7]载体设计上游和下游引物Primer1:5’-ATTCGGTACCAAGCTTGGAAGAAGACTGTATG.;Primer2:5’-CGACGAATTCTCTAGAAGGGGCCGCAC.在两条引物中分别加入KpnI和XbaI限制内切酶位点。PCR产物回收纯化后，并且和T载体连接，转化后用AMP进行筛选KpnI和XbaI 酶切，回收片段，同样消化pSNAV并回收载体，连接，转化，挑选克隆并用KpnI和XbaI酶切鉴定，测序鉴定，命名为pSNAV-Kringle5。腺伴随病毒包装由本元正阳基因公司完成。腺相关病毒转染效率实验:将生长至融合期脐静脉血管内皮细胞消化，按照预先设计每个培养皿细胞数105 个，50mL/L CO2孵箱中培养24h后换液，根据MOI=50加入5×106v.g rAAV- Kringle5及含有100g/L胎牛血清高糖DMEM培养基继续培养48h后，在荧光显微镜下观察荧光强度。血管内皮细胞及视网膜神经细胞抑制实验[8]（MTT法）：取两个96孔培养板分别加血管内皮细胞和视网膜神经细胞.，每孔加入细胞数约为105个,加培养液至200μL，将其放至50mL/L CO2孵箱中培养24h时细胞融合时换液。按设计MOI=50,实验组每孔加入rAAV-Kringle5病毒颗粒约 5×106 个，阴性对照组加入rAAV-null病毒颗粒约5×106个，空白对照组加营养液继续培养48h,加MTT 20μL，4h后加DMSO 200μL，震荡5min，用570nm测定A 值。
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